大型谱系网络揭示了阿瓦尔社区的社会实践

　　对于考古研究，优先采样了石油骨头和牙齿（补充表1）。在布达佩斯的Hun-Rch考古学学院专用的古代DNA实验室设施中准备样品 。使用UVC光对样品表面进行污染 ，并通过机械拆卸清洁。通过钻孔或粉末化获得约25–50 mg的骨粉，并转移到德国莱比锡的MPI-Eva
。DNA提取和随后的实验室步骤是在MPI-EVA的古老DNA核心单元中完成的。使用基于二氧化硅的方法优化用于恢复短DNA片段的方法35
，从25 mg和52 mg粉状样品材料中提取DNA 。简而言之，通过在2.0-mL Eppendorf Lobind管中的样品材料中添加1 ml提取缓冲液（0.45 m EDTA ，pH 8.0
，0.25 mg ml – 1蛋白酶K，0.05％Tween-20） ，并在37°C下在37°C下旋转16 H35,35,35,36
。如先前所述
，使用自动液体处理系统（Bravo ngs工作站B，Agilent Technologies） ，使用二氧化硅涂层的磁珠和结合缓冲液D从150 µL裂解物中纯化DNA
，如前所述36。洗脱体积为30 µL 。在DNA提取过程中，带有没有样品材料的萃取空白
。 　　使用自动版本的单链DNA-Library Preparation 37详细描述的单链DNA-library Preparation 37从30 µL提取物中制备DNA文库。在文库制备过程中 ，添加了大肠杆菌尿嘧啶 - DNA - 糖基酶（UDG）和大肠杆菌核酸内切酶VIII
，以从分子内部去除尿嘧啶 。从样品DNA提取物和提取空白中制备了库，并添加了进一步的阴性对照（库空白）
。使用两个定量PCR分析确定库的产量和库制备效率38。如前所述38 ，使用Accuprime PFX DNA聚合酶通过PCR扩展标记了图库特异性指数 。如先前所述，使用SPRI（固相可逆固定化）技术对索引库进行扩增和纯化38
。 　　将样品和对照库富含1,237,207个信息性SNP（一种常用于现场使用的方法
，称为1240K Capture40），目标是394,577个SNP ，首先在参考文献中报道。41（390k面板）和842,630 SNP在参考文献中首次报道 。42（840k面板）。使用Bravo ngs Workstation B连续进行了两轮1240K捕获
。将多达20个库汇总在一起
，并在HISEQ4000测序平台（Illumina Technologn）上进行了单读或配对的测序。基因组中1,237,207个地点的平均覆盖率为2.6倍（中值2.25×），总共进行了440个1240k富集的文库 ，对应于708,514 1240k SNP的中位数至少覆盖了一次（补充表1） 。 　　原始测序的读取数据（FASTQ文件）是通过NF核/急切v.2.3.2 Pipeline43（https://nf-co.re/eager）处理的
。为了删除适配器和少于30个碱基对的简短读数
，使用了适应性v.2.3.144。然后，使用BWA V0.7.17 ALN/SAMSE ARIGNMENT ALGORITHM45映射到人类参考基因组HS37D5 ，分别设置为0.01和1,024 。然后使用Samtools v1.9（参考文献46）中使用-Q（Q30 -Reads）丢弃的PHRED映射质量少于30的读数
。然后
，我们使用PICARD工具标记功能（https://github.com/broadinstitute/picard）删除PCR重复。为了估计映射片段末端的胞嘧啶至胸腺胞嘧啶taphonomic脱氨基的量，我们使用了MapDamage V.2.0（参考文献47）在100,000 Q30读取的子集上运行 。使用ANGSD v.0.910（参考文献48）评估X染色体杂合度水平 ，在男性个体中估计了外源人常染色体DNA污染
，并使用Schmutzi49估算了男性和女性的mtDNA污染
。Schmutzi还用于重建每个个体的共有线粒体基因组序列，用作HaplogRep2的输入（参考文献50） ，以分配线粒体单倍型。为了在扩展数据中的图形表示图4中，将所有线粒体单倍群修剪为前三个字符 。如果两个人分别有两个字符和三个字符的分辨率
，则将两个人的单倍群都缩小到前两个字符
。从该地块中排除了只有一字符分辨率的个体。 　　使用两种不同的方法和结果比较了Y染色体单倍体 。Y染色体变体是从BAM文件中的样品中调用的，这些样品估计使用Samtools v1.946 mpileup和uipCaller（https：//github.com/stschiff/schchiff/sequencetools）使用samtools v1.946 mpileup and pi.upcaller（https：//stschift/sequencetools） ，其遗传性别是男性或未分配的。使用软件YHAPLO（https://github.com/23andme/yhaplo）进行Y-chromosome单倍群分配
，并使用ISOGG面板V.11.349作为参考（https://isogg.orgg/tree/;访问日期：20223 FeBre）作为参考
。还使用y-linege-track-tracker子命令“分类” 51定义了y染色体单倍群，使用作为参考面板isogg y-haplogroup树v.15.73（https://isogg.org.org/tree/）;在这种情况下 ，输入文件是来自每个人的基因型
，使用Atlas（https://bitbucket.org/wegmannlab/atlab/atlas/)52呼叫工具进行估算，核算后 - 验证后损坏模式和基本得分重新计算模式 ，并估计使用ATLAS ATLAS工具PMD和ReCal pmd和Recal pmd和Recal。 　　然后
，考虑了两个参考面板之间的差异，然后比较了两种方法的结果 。如果两种方法产生了深度分歧的结果（即前两个ISOGG字母数字分类符号） ，或与个体之间估计的相互遗传相关性不一致（在生物学相关性部分中描述）
，则使用Software pathynder53进行了单倍型的评估，以进一步研究了单倍群的评估for sample placement provided by GitHub with the software and as input files the bam files filtered for phred mapping quality more than 30. In any other case, the conservative results from Y-LineageTracker (the column Key haplogroup) were considered reliable, given the more-stringent estimation of the genotypes and the updated ISOGG Y-chromosome phylogenetic tree version. 　　The results of the whole procedure can be found in Supplementary Table 1. PileupCaller (https://github.com/stschiff/sequenceTools) was used to carry out genotype calling from the q30 reads with the --randomHaploid flag that calls haploid genotypes by randomly choosing one high-quality base (phred base quality score ≥30) on the 1240k panel (pseudodiploid呼叫）
。我们还使用了 - singLestrandMode ，它仅通过忽略与前向链链和鸟嘌呤 - 腺嘌呤 - 腺嘌呤多态性在读取相反的链条时读取的胞质 - 胸腺胞多态性时仅删除与单链DNA库观察到的真实胞嘧啶对胸腺嘧啶脱氨酸。 　　为了在扩展数据中产生Y-chromosom的单倍型图，所有单倍型命名法均被修剪为前三个字符 。从图中排除了ISOGG符号少于三个字符的单倍体
。完整的Y染色体单倍体可以在补充表1中找到。 　　我们发现线粒体污染估计值低（补充表1） 。大多数人小于5％
，只有五个样本的值在5％至10％之间
。其中，我们排除了一个具有7％污染的女性（RKF048） ，一个人（KFJ019）具有5％的污染和模棱两可的性别确定（可能污染的间接迹象）；其余男性的核污染低
，因此被保留进行核基因组分析。我们还发现男性个体之间的核污染估计低 。我们排除了另外四个人的价值超过7％的人；RKF094（15％的污染）仍被计算在这一相关之中，因为与其他个体密切相关性很高（补充表4）
。我们还排除了覆盖范围特别低的个体（超过20,000个SNP） ，因为它们实际上不可用于进一步分析（详细介绍了以下各节中的特定分析的较高覆盖阈值的其他过滤）；其中包括两个人也被排除在污染中
，还有另外15个人仍然显示出很高的紧密相关性（RKF225，HNJ005 ，HNJ009
，HNJ009和RKF128）。我们保留了419个人进行进一步的分析，413个不包括一对相同的对 ，其中424对
，其中424对包括KUP和KFJ站点的先前发表的个体10（补充表1） 。然后，我们将它们与一个参考全基因组的面板合并 ，该面板由2,280个现代个体使用微阵列技术进行基因分型，并使用商用的humanorigins chip54,555,56
，并以前出版了使用全部1240k捕获方法或使用全部整个生机的数据获得的数据，以相同的1240k捕获方法或相同的1240k SNPS来对古代个人的基因型进行了测序。测序10,27,54,55,57,58,59,60,61,62,62,63,64,65,66,66,67,67,68,69,72,72,72,73,74 ，从Poseidon（https://poseidon-framework.github.io）下载
。我们生产了两个数据集
， 一个包括现代数据和SNP在1240K站点和HanumoRigins SNP芯片（1240KHO数据集，约600,000个SNP）之间重叠 ，另一个与古老的数据和整个1240K面板（1240K数据集）。 　　我们使用LSQProject和AutoShrink参数在1240KHO数据集上使用SmartPCA v.6.0.1中的SmartPCA V.16000进行了主要组件分析（PCA）
，以将古代个体的基因型（包含丢失的数据的可变量）投影到现代化的概述中，以投影古代个体的基因型） 。对于一个PCA（图4A） ，我们使用了最初像参考27所述的参考54中的Eurasian人群（欧亚PCA）的子集
，而对于另一个PCA（扩展数据图8B），我们仅使用西欧亚大陆人口的标准子集（西欧PCA） ，如最初报道的76和当时的PCA
。 　　我们使用了AdmixTools软件包的软件QPWAVE/QPADM（V.1520）56在1240K DataSet41,77上运行基于F4统计的祖先分析。使用带有5厘米块的块刀刀估算了计算出的F统计数据的标准误差 。我们使用默认的AllSNP：无参数
，从而使用每个测试的所有组之间的SNP重叠来计算所有基础F4统计数据
。We used a set of outgroups (or right populations) that are similar to those of a previous study10 that included representatives of ancient Eurasian lineages (European Mesolithic hunter-gatherers, European/Anatolia Neolithic, Levant Neolithic, Iranian Neolithic for western Eurasia, and ancient North Eurasian lineage (ANE76), ANA, ancient Siberian and southern East Asia for eastern Eurasia, and关键的非欧洲裔（非洲，南亚 ，美洲原住民），否则
，否则hte hte代表mbuti.dg，levant_n ，onge.dg
，iran_gates_hg，ehg ，ehg
，ehg，ehg ，mixe.dg
，anatolia_n，anatolia_n ，anatolia_n
，anatolcave_n.sg，devilscave_sg ，tarim_em_em_emba and yrrrrrimy yrrrrrrrrimy yrrrrimy yrrrrrim yrrrrrrrrrrimy y.参考10是，我们使用了Tarim_emba1（参考72）
，而不是三个俄罗斯_BOLSHOY个人65，它是一个高覆盖范围的数据集 ，比文献中任何其他可用的高位祖先都更好地代表Ane sineage73。 　　为了选择源（或左种群）来建模新测序个体的混合血统（目标）
，我们遵循以下基本原理 。在以前的研究中可获得的数据中，我们仅选择了（超过两个个体）的古代人群 ，这些人群大约是同期的
，或者是在之前的之前或时间上的，但与以前建议的人相距尽可能接近我们目标个体的时期78
。在我们的选择中 ，我们还考虑了先前对Avar时期的基因组研究的发现
，以及在地理，历史和考古学上相关的人群。这导致选择了13个不同的源组属于3个类别 。（1）代表东欧亚草原血统的来源 ，其中包括古老的人口和文化
，从东欧亚草原及东亚周边地区的上一段时间内获得
。（2）在阿瓦尔（Avar）时期之前的喀尔巴阡盆地盆地中发现的“阿瓦尔前 ”人口。（3）从庞蒂奇和中亚草原（“草原”来源）提供的相关时间（第一千年和）人口 。 　　这些来源的两种组合和三向组合导致总共进行了190种不同的组合，所有组合的qpwave p值远小于0.05 ，这意味着这些源相对于一组外部组有足够的区别。因此，它们是要测试的合适来源76（补充表5）
，应用以下基本原理，与以前讨论的建议相同78
。我们首先使用东欧亚草原组的所有组合以及Avar和草原的来源测试了双向混合来源。如果我们可以拒绝一个但不能拒绝另一个 ，则在阿瓦尔和草原源模型之间（如果一个人有p< 0.05 we can reject; if the other had P  >0.05我们不能拒绝）
，我们认为我们不能拒绝（p> 0.05）是有效的 。If the two-way models did not significantly reject one or the other between the pre-Avar and steppe sources (both with P  >  0.05) or produced no fitting results at all (both with P   < 0.05), we proceeded by testing three-way competitive models, including the eastern Eurasian populations and contrasting directly the pre-Avar plus steppe sources as well as pre-Avar plus pre-Avar, accounting for the variability in ancestry and time阿瓦尔前人口之间的时期
。 　　如果三向模型导致了阿瓦尔前加上草原之间的两个对比来源之一，将另一个模型重置另一个（使其估计的混合比例为0％） ，我们认为这些模型。如果对比来源具有中间混合物的比例
，我们认为只有那些可以拒绝阿瓦尔（Avar Per-Avar Plus Plus Plus Plus Steppe或Avar Pres-Avar Plus Pred Pre-avar）之间的两种情况之一的测试 。在前阿瓦尔或草原源之间仍未解决或不拟合模型的个体被视为未解决或失败，并且不用于进一步的荟萃分析或解释
。 　　为了简单性和一致性 ，我们选择了一个东欧亚的来源
，包括我们的图和摘要统计数据：DTI地区Avar早期时期的遗传上最东部的个体（dti_ea_east;图4;图4;图4;先前出版的10），并在其中添加了来自相同库存的早期概述的数据（概述）的数据。我们始终使用这个东方代理 ，除非在少数情况下未产生合适模型的情况下
，而不是另一个代理，这表明了东部组件中现有的异质性 ，尽管对于西方来源的可变性却大大降低了（补充表5） 。然而，重要的是要注意
，尽管dti_ea_east是总体产生更多合适模型的来源，但其他几个东方来源（包括latexiongnu ，ar_xianbei_p_2c）也导致了许多同样拟合的模型（补充表5）
。 　　我们使用日期V.753（https://github.com/priyamoorjani/dates）盖上了东 - 新的欧亚祖先祖先混合物的平均时间
，估计了来自四个地点的大多数Avar时期个人。该方法基于与许多混合约会方法70,79相同的原理 。它假设两个混合源人群，一个东亚和西欧亚大陆地区之间发生了混合事件
。在我们的案例中 ，我们使用了蒙古人63中的Ulaanzuukh_slabgrave或主要QPADM模型中使用的dti_ea_east组的无用和高SNP覆盖的LBA/IA组
，作为ANA Proxy和Ana Proxy和Ana carpathian carpathian carpathian castin seart Sarmatian and sarmatian and sarsian and sysian and sysial a a ana ana ana ana ana ana ana_eeast组。日期计算了测试个体与源源人群之间每对可用重叠的SNP之间的祖先协方差系数的衰减，而遗产距离造成的距离Windows70则衰减 。人口遗传学理论表明 ，如果结合发生
，则可以将指数函数拟合到加权血统协方差的衰减中，并且几代人的数量可以从这种功能的参数中得出79的参数。从理论上讲 ，混合事件的较高年龄限制仍会产生可检测到的衰减的年龄限制约为4,000年80岁
。实际上
，由于染色体重组的产生时间不足，无法开始产生预期的衰减模式81,82 ，因此无法正确检测到最近的混合事件（大约一到三代前）。为了估计拟合的良好性，日期使用千斤顶刀方法计算标准误差和z得分
，一次掉落染色体 。我们将最大距离参数设置为0.5 cm，垃圾箱尺寸为0.001 ，起始遗传距离为0.45 cm
。集成最小二乘函数用于估计自混合参数以来的世代数量。如果原始数据显示没有衰减
， 指数函数不能拟合或拟合低z得分，少于2个 ，并且不合理的约会估计值为负值
，或者在4，000年前的理论最大最大时间内大数字 。所有显示此类值的样品也被推断为PCA和QPADM不合时间 ，并将其排除在我们的推论之外
。对于扩展数据图9
，我们还包括了小于2的Z得分（显示为透明度因子）的日期，因为它们部分反映了我们可以直接在谱系中观察到的最近（例如第一代或第二代）混合事件。这些日期估计几乎并不显着 ，因为尚无衰减模式可以符合指数功能
，但是有些仍提供定性正确的最近混合日期（补充表1） 。我们使用每一代70年的标准29年来转换自混合以来几年中的发电时间，并将个体的Avar-Period年代顺序作为死亡日期
。 　　我们将KIN16用作评估我们研究的四个站点中每对个体之间生物学相关性的主要方法 ，尽管我们用单倍型-IBD（下面详细介绍）和面包（https：//github.com/jonotuke/breaduke/breadr）验证了相关性估计值（补充信息）。鉴于，单链UDG-HALF处理的库仍然在最后两个基本对的映射片段中保留了大约10–30％的C到T脱键
，因此，对于此分析 ，我们使用Bamutil V.1.1.1.13（cop as cop .83 and cop .83）和这些分析模块掩盖了两个基本对 。亲戚可以自信地识别一级和二级关系
，同时区分亲子和兄弟姐妹关系16
。尽管该方法没有明确区分第二级的关系，但它输出了有关IBD共享的信息 ，这些信息可以有助于区分Avuncular和祖父母与祖父母的关系。我们模拟了Avuncular
，半兄弟姐妹和祖父母的祖父对（补充信息），以表明IBD段的长度和IBD段的数量可用于区分Avuncular和祖父母与祖父母的关系 ，而半同胞则与两种情况重叠 。此外
，亲属提供了有关三级关系的指示（在4×序列覆盖范围内精度约为70％）。尽管这些分析不足以自信地识别二级关系中，并且可能缺乏识别三级亲戚的能力 ，但是当与其他信息结合使用时
，它们可能至关重要，例如来自不同对的谱系信息以及有关死亡时代的骨骼时代的信息 ，性别，性行为和非洲人的单身型生殖器（y Chromosome and y Chromosome and y Chromosome and Mtdna）
。因此
，在构建和交叉检查生物学相关性的血统书时都考虑了所有这些信息 （补充信息）。为了清楚起见，我们编号了我们发现的血统书 ，并将一个谱系定义为一组个人
，这些个体可以直接与密切的遗传相关性联系在一起，并且可以追溯到下降线 。在我们重建最大的血统（来自RK的146个人）的情况下 ，我们将其分为五个谱系
，从五个不同的11个“创始人男性
”（包括多个兄弟作为联合创始人）中降下
。 　　我们遵循了KIN16的方法部分，并使用MSPRIME84模拟了八个二倍体个体 ，其突变率的默认参数（每代1碱每一代为1×10–8）
，重组率R R（每代1级1×10–8）和有效的人口大小为3,000。对于每个人，我们模拟了22个染色体 ，其长度与GRCH38.P14基因组相同 。为了形成血统
，我们首先为每个父母模拟了一组重组的染色体，并将它们组合起来创建后代
。我们从软件PED-SIM85中获得了每个染色体的重组点。我们将基因型密度和读取的覆盖范围与样品的读取匹配 。我们模拟了60种此类血统（参见参考文献16和补充图17和18中的图S9）
。 　　可以通过直接的方法在遗传上测试血缘：计算沿个体基因组的纯合部分的长度和数量。该分析通常定义为ROHS 。为了估计ROH ，我们采用了一种称为HAPROH86的方法，该方法旨在推断出它们在伪双重
，低覆盖和较高的DATA古代DNA样品上
。该方法在经验上也已证明与基于同一古代估算的二倍体基因组计算的独立ROH估计值高度一致。沿个体基因组的长ROH（超过4厘米）的特定模式是其一些最近祖先（最高二级COSINS86）之间的近亲工会的典型代表 。在扩展数据中，我们使用Haproh（https://pypi.org/project/project/haproh/）实现的Python软件包绘制了ROH。 　　基于单倍型的分析（例如下面描述的IBD）需要个人的父亲和母体染色体的相位信息 ，而这反过来又要求沿基因组几乎没有丢失的数据
。最近的研究表明
，从古代基因组中获得此类数据87,88在其他类似情况下可靠，覆盖超过0.5-0.7倍 ，并且还通过同时统计插入和阶段应用于1240K捕获数据10,89。我们使用了地图集（https://bitbucket.org/wegmannlab/atlas/)52的古代DNA特异性基因型呼叫者MLE MLE功能来称呼基因型的可能性 。地图集还可以计算我们在同一测序运行中测序的库中进行批处理的基础质量重新校准（恢复函数）
，这考虑了特定的测序误差
。ATLAS recalibration also corrects the base qualities accounting for the empirical ancient DNA-damage pattern observed from the data and reduces the effect of reference bias introduced by genome mapping by relying on a list of 10 million highly conserved genomic positions across 88 mammal species downloaded from ensembl (https://grch37.ensembl.org/).我们称基因型的可能性为大约2000万SNP的整个1,000基因组SNP面板，并将这些调用用作GLIMPSE90插入的输入数据 ，为此
，我们使用了分阶段的1,000个基因组第3阶段-3释放数据作为参考单倍型91。如前所述，我们使用HAPMAP的性平均遗传图瞥见了默认参数 ，如前所述88 。该功能GLIMPSE_PHASE用于对2,000,000个碱基对的基因组块同时进行插补
，并进行200,000个碱基对的基因组块
。然后，我们使用集成的Glimpse_ligate和Glimpse_Sample函数 ，BCFTools v1.3（参考文献88,92）在每个1240K位置都具有基因型后验概率，以获得最终阶段/估算的VCF文件。 　　我们用AnciBD进行了单倍型IBD分析
，ANCIBD是一种最近开发的方法，说明了古代DNA93的高相位误差 。该分析搜索了两个个体的基因组的长单倍体块（IBD）相同的基因组 ，这意味着它们在过去的某个时候被共同祖先遗传而来
。因此
，它可以像亲属一样检测亲密的遗传亲属（第三至第三个关系），但它也可以在生物随机性范围内检测到更遥远的关系 ，最高六度。85 。但是
，它需要更高的覆盖范围，从而减少相对于亲属分析的个体数量
。我们使用了估算的或分阶段的数据 ，其中包括那些使用我们的伪 - 荷兰语呼叫获得超过450,000个SNP的个体
，插算后具有基因型后验概率的SNP大于0.99。我们使用ANCIBD的Hapblock函数来执行默认参数的成对估计，并且仅考虑了超过8 cm的共享块 ，其中包含超过220厘米的centimorgan 。为了进一步过滤可能的假阳性命中
，我们仅认为共享的IBD段超过12 cm，如果一对个人的段小于16 cm ，则只有当它们具有多个这样的段以上时，我们才将其包括在内（补充表4）。我们使用Cytoscape v.3.9.1（参考文献94）来绘制成对IBD关系的网络
。 　　对于IBD网络分析
，仅包括Avar-Period个体。因为在评估性别特定的活动和联系模式时，亚成年人可能是一个混杂因素 ，所以我们建立了一个仅包括成年人的额外网络 。成年阈值设定为18岁
，基于最年轻的父母的估计年龄的下限
。整个网络由257个节点组成，其中有195个代表成年人（105名男性和90名女性）和来自四个考古遗址的62个亚成年人（35名男性和27个女性）。网络的链接由IBD连接表示 ，如果考虑整个网络
，则数字为2,658，如果仅选择成年人 ，则为1,211（补充表4） 。在我们的分析中
，我们考虑了未加权和加权网络
。未加权的网络代表了一种配置，其中发现的IBD关系定义了链接的存在或不存在 ，而不论其价值如何。但是
，在加权网络中，链接由分析的最大IBD值加权 ，从而可以评估相关性的幅度 。这两个网络都是无方向性的，因为两个人之间的IBD段共享没有方向性
。 　　学位中心度（K）定义为节点持有的链接数。Avar-Period成人网络的平均度为18.07 。考虑到链接上的分配权重
，在我们的情况下，这是每个节点附加链接的权重（max_ibd）的总和 ，平均强度w为1,620.54
。当性别被认为是节点属性时
，男性和女性之间的程度和强度分布显着差异（图3C和补充图47和48）。对于男性，K为27.39 ，W为2,392.37
，而对于女性，K为7.21 ，W为720.08 。两样本的Kolmogorov – Smirnov检验显示
，男性和女性的程度和力量分布之间存在显着差异（p <0.05）。 　　通过将埋葬的考古位置视为模块，可以将节点的度中心性分配到模块内（kW）和模块之间（KB）之间
。KB/K比表示模块间连接与总连接的比率 ，该连接的范围在0到1之间
，其中0表示相关个体仅埋在同一站点，1表示相关个体仅埋在不同的位置。为了评估该比率 ，还必须考虑学位中心性的价值，因为具有较小程度的中心性的个体可能具有较高的Kb/K比 。分析的其他结果在补充图2中进行了解释
。44–48。使用R进行分析
，并使用带有IGRAPH软件包95的自定义R脚本计算节点测量 。 　　在德国曼尼海姆的Curt Engelhorn中心考古计量法中，在同位素和放射性碳实验室的相同骨料中 ，在同位素的相同骨料中进行14C约会和同位素分析（Δ13C
，Δ15N）
。清洁骨样品，化学处理和使用改良的纵向方法96提取胶原蛋白。为了对碳和氮的稳定同位素分析 ，将所得胶原蛋白的一份三份燃烧在元素分析仪（pyrocube
，elementar）中，同位素比通过同位素比率质谱法（精度 ，元素）测量 。相同的胶原蛋白提取物用于14C约会
。超滤以去除短链的大分子后
，使用市售系统（Age3，Ionplus）或定制制造的系统将胶原蛋白简化为石墨。使用MICADAS型加速器质谱仪（IONPLUS）来确定常规的14C年龄97 。在软件Oxcal V.4.4.4（参考文献98）中对14C日期进行了建模 ，并使用Intcal20校准陆地样品（参考文献99）
。14c日期的贝叶斯建模包括先前概述的方法提供的相对时间顺序信息的先前信息24。补充表2和3和补充信息中给出了模型结果和详细说明 。 　　对于所有腹膜测量
，在布达佩斯的考古学研究所的实验室中提取了牙齿搪瓷。用带有磨损尖端的DREMEL工具清洁牙齿的表面，然后 ，在进行10分钟的超声浴后，将牙釉质小心地用钻石涂层的牙科钻头粉末粉末
，直到获得25-50 mg
。所有样品的锶分离化学遵循先前的方法100。在南非Rondebosch的开普敦大学地质科学系的MC-ICP-MS设施上对NU仪器NUPlasma HR进行了分析，并遵循了先前所述的101111111101的程序和参考值（SRM987 87SR/86SR ，为0.710255） 。过去的4.11 Software102用于同位素数据的统计分析
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。