编程无活性的RNA结合小分子成生物活性降解器

　　所有DNA模板和引物均从集成的DNA技术（IDT）购买，并没有进一步纯化。化学合成的RNA寡核苷酸和寡核苷酸竞争者是从佛法获得的 ，并根据制造商的推荐方案脱离 。脱身后
，根据制造商的协议，使用PD-10 Sephadex柱（GE Healthcare）对RNA进行脱毛
。所有寡核苷酸浓度均通过其在90°C下的260 nm的吸收以及制造商提供的相应灭绝系数确定。化合物MZ1购自Medchemexpress 。 　　在台风FLA9500可变模式成像仪（GE Healthcare）上获得了所有自显影图像和溴化乙锭染色图像
。使用AFP Imaging Mini-Medical/90系统获得蛋白质印迹图像。使用图像J（V.1.8.0_112）对这些图像进行量化 。使用Microsoft Excel（Office 365）和GraphPad 8（V.8.0.2）进行所有数值计算
。 　　显示为代表性印迹或凝胶自显影图的实验结果成功复制了两次或更多次 ，以确保报告结果的可重复性。图中提供了重复的数量和类型以及统计意义 。 　　通过在95°C的95°C加热30 s加热
，然后在冰上冷却5分钟，将MIR-155先前的RNA（500 pmol）折叠在1倍折叠缓冲液（FB； 20毫米HEPES ，pH 7.5 、150 mm NaCl和5 mm KCl）中。接下来
，将50 nm的MIR-155-Chem-CLIP添加到MIR-MIR-155之前，并将样品在37°C下孵育过夜
。交联的MIR-155预先在Dynabeads上被捕获 ，并根据制造商的协议洗脱。根据制造商的协议，使用基因特异性底漆（5'-Cagacgtgctcttccgatctctctctctctctctctctctctctaatat-3'）和Superscript III（SSIIII）进行了截下RNA的逆转录 。根据制造商的协议
，使用RNACLEAN XP（Beckman Coulter）处理RT反应
。使用T4 RNA连接酶I（New England Biolabs（NEB））将ssDNA适配器（5'AgaTcggaagagagcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtgtgtgtgtgtag-3c Spacer）连接到纯化的RT产物，然后根据制造商的协议添加了RNA清洁XP。使用以下底漆使用接口聚合酶（NEB）扩增结扎的cDNA：5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'和5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGAT-3' 。用贬低的丙烯酰胺凝胶和乙醇沉淀纯化PCR反应
。根据制造商的协议将纯化的PCR产物克隆到NEB的PMINIT 2.0载体中 ，并由Eton Biosciences测序。 　　MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞（HTB-26; ATCC）在带有-glutamine和25 mM HEPES（Corning; 10-041）的RPMI培养基中培养
，并补充了10％（v/v）胎牛血清（FBS； fbs; Sigma-Aldrich; Sigma-Aldrich; sigma-Aldrich; f2442）和1×coin-15140122） 。 　　在DMEM/F12 50/50培养基中培养MCF-10A乳腺上皮细胞（CRL-10317; ATCC），含有-glutamine和15 mM HEPES（Corning; 10-092-CV） ，其中含有20％（v/v）FBS
，1×抗生素 - 抗生素 - 抗生素 - 抗生素 - 抗生素 - 抗生素溶液（corerm corerm corerm eperm eprerm; 30-004-CI），20 ngIS ，20 ngIS
，20 ngIS，20 ngIS ，20 ngIS
，ci，（Pepro Tech； GMP100-15） ，100μgml-1胰岛素和0.5 mg ML-1氢化可的松（Sigma-Aldrich; H0888）
。 　　CFPAC1导管腺癌上皮细胞（CRL-1918; ATCC）在1×IMDM培养基（Gibco，12440053）中培养
，其中10％（v/v）FBS和1倍抗生素 - 抗生素 - 抗肌动物疗法。 　　根据制造商的协议，在使用EGM-2子弹套件（Lonza; CC-3162）制备的EGM中培养HUVEC（LONZA ，CC-2517） 。 　　将HELA细胞（CCL-2
，ATCC）和HEK293T细胞（CRL-3216，ATCC）培养在1×DMEM培养基中 ，并用4.5 g L-1葡萄糖（Gibco
，11965092）补充了2 mm谷氨酰胺或1％glutagro（Corning; Corning; 25-015-CI and 1％），Ventect and 1％cin-1×cin-vicncin-vin-FBS
。 　　MIA PaCa-2 pancreatic adenocarcinoma cells (CRL-1420; ATCC) and CRISPR lines derived from MIA PaCa-2 pancreatic adenocarcinoma cells (Supplementary Fig. 6) were cultured in 1× DMEM medium with 4.5 g l−1 glucose supplemented with 1% Glutagro, 1× penicillin–streptomycin solution and 10% (v/v) FBS. 　　从ATCC中获得了Namalwa（CRL-1432）和Raji（CCL-86）Burkitt淋巴瘤细胞和HL-60（CCL-240）（CCL-240）髓样白血病细胞 ，并在rpmi培养基中培养
，并在rpmi培养基中培养了-glutamine培养基和25 mM HEPES，并补充了10％（V/V/v/v/v）和1×1×1×1×1×1×1×1×1×1×1×1×sttrtstr。 　　除HUVEC（<6）和HeLa细胞（<30）外 ，所有细胞系的通过数均小于20 。在使用PCR支原体测试试剂盒（Promocell）进行实验之前
，检查所有细胞是否没有分支污染。 　　过表达过表达野生型的质粒是从Genecopoeia（HMIR0358）购买的，而突变质粒是由Genescript自定义合成的
。将MCF-10A细胞在60毫米菜肴中以约70％的汇合度接种 ，并用质粒（每盘2 µg 2 µg）转染，该质粒（每盘2 µg）使用脂肪触摸前155年（扩展数据图9A）使用脂肪触摸3000（Invitrogen（Invitrogen））
，根据制造协议。将细胞在转染鸡尾酒中孵育6小时，然后更改为新鲜生长培养基 ，然后再孵育16小时 。然后将细胞胰蛋白酶和播种进行生物学实验
，如以下各节所述
。 　　在为下面的每个靶标指定的化合物处理后，用1×dpbs洗涤一次细胞 ，并被紫外线照射15分钟。根据制造商的协议
，使用Zymo Quick-RNA MiniPrep套件提取总RNA 。根据制造商的协议，将输入RNA（10 µg）与叠氮化琼脂糖珠（单击化学工具）孵育 ，然后添加45 µL反应溶液
，抗坏血酸（250 mm），cuso4（10 mm）（10 mm） ，tris-Hydroproproppropropropproproproppropproppropproproppropropropropproproppropropropropropproppropproppropproppropproppropproppropproppayylylylylylylylylylylylylylylymine;在37°C下孵育2小时后
，将珠洗涤六次，用洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl ，pH 7，4 M NaCl
，1 mM EDTA和0.1％Tween-20）洗涤，并重悬于100 µL释放溶液中 ，其中含有200 mM TCEP和400 MM K2CO3
。将混合物在37°C下孵育30分钟
，然后加入50 µL的800毫米碘乙酰胺，再孵育30分钟。根据制造商的协议 ，将含有RNA的上清液小心地转移到干净的管中
，并由Rnaclean XP珠（Beckman Coulter）纯化 。如“ mRNA和PRI-，PRI- ，PER-PER-PER-PER-PER-和成熟miRNA水平”部分中所述
，使用RT-QPCR分析了纯化的RNA
。 　　MDA-MB-231细胞在100毫米直径的菜肴中生长至约80％的融合，用DMSO（媒介物； 0.1％（v/v）处理 ，所有化合物处理的细胞中的最终浓度）
，100 nm Pre-MIR-155-155-155-155-Chem-Clip或100 nm Controle探头探针剪辑clip，用于6 h h。通过在MIR-155-酰胺前（指示为0–1μM）进行预处理MDA-MB-231细胞进行2小时 ，然后添加MIR-155-155-Chem-CLIP（100 nm）并孵育16小时16小时，进行了竞争性化学纸LIP 。 　　MIA PACA-2细胞在100毫米直径的菜肴中生长至约90％的汇合
，用DMSO（载体），Jun-Chem-CLIP或CTRL-CHEM-CLIP在指定浓度上处理6小时
。通过在指定的浓度下用JUN-2小时预处理MIA PACA-2细胞进行2小时 ，然后添加Jun-Chem-CLIP并再孵育5小时
，进行了竞争性化学纸张。After cross-linking and RNA isolation as described in the ‘General protocol for cellular Chem-CLIP’, the RNA samples were supplemented with a click reaction mixture consisting of disulfide biotin azide (Click Chemistry Tools, 1168, 0.5 µl, 100 mM), CuSO4 (1 µl, 10 mM), THPTA (1 µl, 50 mM) and sodium ascorbate (1 µl,250毫米） 。将反应在37°C下孵育3小时。孵育期后，添加了100 µL链霉亲和素珠（肌链霉素C1珠； Thermo Fisher Scientific） ，并将样品在室温下孵育1小时
。洗涤和洗脱步骤与“细胞化学卷曲夹的一般协议 ”部分中所述的步骤相同。 　　HeLa细胞在直径60毫米的菜肴中生长至约80％的汇合
，并用媒介物，MYC-Chem-CLIP或对照探针CTRL-CHEM-CLIP处理5小时 。MYC竞争性化学纸胶是通过在指定浓度下用MYC-defare的HELA细胞进行2小时进行的 ，然后添加Myc-Chem-CLIP（10μM）
，并将细胞孵育5小时
。其余步骤如“细胞化学纸卷曲
”部分中所述进行。 　　根据制造商的协议，使用Zymo Quick-RNA MiniPrep套件提取总RNA 。对于PRI-MIRNA和mRNA ，使用200 ng的RNA使用QScript cDNA合成试剂盒（Quantabio）进行RT
。对于成熟的miRNA
，使用200 ng的RNA与误学II RT试剂盒的总体积为20μl（Qiagen）进行RT反应。随后的QPCR分析（有关引物序列和补充图2-7，请参见补充表2 ，用于引物验证）使用Power Sybr绿色主混合（Life Technologies）或Taqman测定法和Applied Biosystems QS5 384-Well PCR系统（软件V.1.1.3.0） 。对于成熟的miR-155水平，使用IPU-MIR-155 Taqman分析（Thermo Fisher Scientific
，467534）进行Taqman分析
。如前所述，使用ΔΔCT方法分析数据13。 　　将MDA-MB-231细胞或MCF-10A细胞在12孔板中播种约60％的汇合 。用化合物 ，LNA-155 Mircury LNA功率抑制剂（Qiagen; 5'Uuauaugcuaauauaaucgugauaggggugu）或媒介物处理细胞或媒介物（0.1％（V/V）DMSO
，在所有化合物处理的样品中的最终浓度）在所指示的培养基中的所有化合物处理的样品中的最终浓度）在生长培养基中的48小时（否则未分布的数据）
。对于洗涤实验，将MDA-MB-231细胞（约40％汇合）与MIR-MIR-155-Ribotac在生长培养基中指定的浓度下处理48小时。治疗期后 ，将细胞用1×dpbs洗涤
，并添加没有化合物的新鲜生长培养基 。然后在处理后的指示时间点（12
、24和36小时）从细胞中收集总RNA。对于与粘合剂和Ribotac进行竞争性实验，在指定浓度下将两种化合物添加到生长培养基中 ，应用于细胞并孵育48小时
。对于miRNA分析
，将细胞用MIR-MIR-155-核能（100 nm）或LNA-155（50 nm）在生长培养基中处理48小时。 　　将CFPAC细胞以约50％的汇合度接种在12孔板中，并在指定浓度下用化合物处理48小时 。将HUVECS细胞在约60％汇合的12孔板中播种 ，并用在生长培养基中以指定浓度制备的化合物处理48小时
。通过将两种化合物在所需浓度中添加到生长培养基中
，将混合物施加到细胞上并孵育48小时，将两种化合物添加到生长培养基中 ，将两种化合物添加到生长培养基中，将两种化合物添加到生长培养基中
，则进行了竞争性实验。 　　MIA PACA-2细胞，无论是未修饰的还是CRISPR修饰的细胞系 ，在12孔板中的汇合度均约为40％
，然后用媒介物（DMSO； 0.1％； 0.1％（v/v）处理，在所有化合物处理的样品中的最终浓度）或在指示浓度下生长培养基中的化合物中的最终浓度 。根据制造商的指示 ，针对JUN（Dharmacon; L-003268-00-0005）的siRNA或用Lipofectamine 3000（Invitrogen
，L3000001）转染了炒siRNA（Dharmacon; D-001810-10-05）
。如上所述，使用Taqman基因表达测定（GAPDH：HS03929097_G1 ，4331182; JUN：HS00277190_S1
，43331182）和Taqman快速高级助理。MIA PACA-2细胞使用了相同的方案，其中RNase L被CRISPR击倒和使用对照指导RNA的细胞 。 　　HELA细胞和MDA-MB-231细胞（无论是未修饰的还是CRISPR修饰的细胞系） ，分别在12孔板中生长至30％或50％的汇合
，用媒介物（DMSO； 0.1％（V/V）处理，在所有复合培养的样品中的最终浓度）或生长培养基中的最终浓度是24小时
。24小时后 ，除去培养基，并用含有化合物的新鲜培养基处理24小时的细胞。对于MYC siRNA研究
，根据制造商的推荐方案，将细胞在12孔板和1 nm的Myc siRNA（Santacruz ，SC-29226）或炒对照（Santacruz
，SC-37007）中（Santacruz，SC-37007）转染 。Namalwa（每毫升0.4×106个细胞） ，HL-60（每毫升0.5×106个细胞
，2 mL）和Raji（每毫升0.7×106个细胞）用媒介物，MYC-RIBOTAC或MYC-CTR处理48小时
。对于Namalwa ，HL-60和Raji细胞
，还使用RT-QPCR测量了RNase L mRNA水平。对于在MCF-10A和MDA-MB-231细胞中进行的研究，还使用Taqman Gene表达测定法（GAPDH：HS03929097_G1 ，4331182; MYC：HS00153408_M1
，43331182）和TAQMAN和TAQMAN 。 　　按照“ MyC荧光素酶报告基因测定器”部分的描述，将HEK293T细胞转染和处理 ，除了12孔而不是96孔板。48小时后，提取总RNA
，并在“ RT – QPCR分析的一般协议 ”部分中对mRNA进行RT -QPCR
。 　　按照以下每个目标指定的处理后，使用M-Per提取试剂（Thermo Fisher Scientific）收集总蛋白质 ，并根据制造商的方案使用Pierce Micro BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质浓度。除了分析SOCS1蛋白（由于其低丰度而使用40μg）外
，大约20μg的总蛋白质已在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上解析 。After transferring to a PVDF membrane and blocking the membrane with 1× tris-buffered saline supplemented with 0.1% (v/v) Tween-20 (TBST; 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.1% (v/v) Tween-20) with 5% (w/v) milk, the membrane was incubated with the primary antibody (see below for each target) in1×TBST在4°C下用5％（w/v）牛奶16小时
。在室温下用1×TBST（每次洗涤5分钟）洗涤膜3次。然后将印迹与IgG辣根 - 过氧化物酶（HRP）二抗结合物在1×TBST中与室温下5％牛奶一起孵育1小时 。用1×TBST洗涤五次（每次洗涤5分钟）后，使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Pierce Biotechnology）检测靶蛋白 ，并使用ImageJ进行定量
。然后在室温下剥去膜（200 mM甘氨酸
，pH 2.2，4 mm SDS ，1％（v/v）Tween-20）
，持续30分钟，并用β-肌动蛋白或GAPDH再次印迹以进行归一化。 　　将MDA-MB-231细胞在约60％的汇合度中播种在六孔板中 ，并在指定浓度下用MIR-MIR-155- ribotac处理48小时 。抗SOCS1初级抗体（细胞信号技术（CST）
，3950s）的使用为1：2,500稀释，然后是抗兔IgG-HRP二级抗体结合物（CST ，7074S）以1：5,000稀释
。剥离后，以1：5,000稀释使用β-肌动蛋白原代抗体（CST
，3700s），然后在1：10,000稀释下进行抗小鼠IgG HRP二抗二抗二抗二抗（CST ，7076S）。 　　将HUVEC（约60％的汇合率）接种在六孔板中
，并在指定浓度下用MIR-155-核糖酸治疗48小时 。抗VHL初级抗体（CST，68547）以1：1,000稀释使用 ，然后在1：5,000稀释下使用抗兔IgG HRP（CST
，7074s）
。如上所述，在“ SOCS1的蛋白质印迹分析
”部分中所述检测到β-肌动蛋白。 　　将MIA PACA-2细胞接种在六孔板中 ，并用媒介物（0.1％（v/v）DMSO；所有化合物处理样品中的最终浓度）或在指定浓度的生长培养基中以72 h的含量达到40％的汇合度左右 。抗JUN原代抗体（CST
，9165s）或抗RNase L抗体（CST，D4B4J）以1：1,000稀释使用 ，然后在1：10,000稀释下进行抗兔IgG HRP（CST
，7074S）。如上所述，在“ SOCS1的蛋白质印迹分析”部分中所述检测到β-肌动蛋白
。 　　将HELA细胞（约30％汇合）或MDA-MB-231细胞（约60％汇合）在六孔板中播种 ，并在生长培养基中的指定浓度下用媒介物或化合物处理24小时。去除含化合物的生长培养基，并用含有化合物的新鲜生长培养基代替 。如上所述
，将细胞再孵育24小时，然后收集总蛋白
。用媒介物 ，myc-ribotac或myc-CTR处理Namalwa细胞（每毫升为0.4×106个细胞
，10 mL）48小时（单剂量），然后收集总蛋白质。以1：1,000稀释使用抗MYC抗体（CST ，5605s）
，然后在1：5,000稀释下使用抗兔IgG HRP（CST，7074S） 。使用1：3,000稀释 ，然后进行直接成像（由于该抗体是HRP偶联物
，因此无需二级抗体），使用了抗GAPDH原代抗体（CST ，51332S）
。该膜未剥离
，直接用抗GAPDH抗体将膜印迹以进行归一化。 　　按照“ MYC的Western印迹分析 ”部分所述进行相同的程序，除了初级抗体是抗BRD4（细胞信号技术 ，13440S），在1：1,000稀释度 。MZ1对BRD4和MYC蛋白水平的影响得到了验证
，并在补充图8中显示
。 　　60毫米直径（约80％汇合）中的HEK293T细胞与4 µg的质粒共转染，该质粒的质粒构成了与荧光素酶融合的SOCS1（Genecopoeia ，HMIT021399-MT06）
，并使用质粒前表达1 µg（使用1001 prym-15）（使用野生型二极管），使用野生型乘坐100 µg（polige） ，使用野生型二极管（PORIME）。制造商的推荐协议 。转染后
，将细胞接种到96孔板（每孔7,000个细胞）
。孵育12小时后，将细胞用DMSO（媒介物为0.1％（v/v））或MIR-155-Ribotac处理。通过在0、10和100 nm的MIR-155-Ribotac处理48小时 ，测量剂量 - 反应
，并通过治疗6 、24
、48和72 h来测量时间过程 。根据制造商的说明，使用双GLO荧光素酶测定系统（Promega ，E2920）来测量荧光素酶活性。 　　MYC IRES荧光素酶质粒通过Genscript（U6617GC310）定制
，通过在PCDNA5载体中插入两个点击甲虫荧光素酶（CBR和CBG）之间的MYC IRES序列
。根据制造商的推荐协议，使用JETPRIME（Polyplus ，101000027）共转染60毫米直径（约80％汇合）中的HEK293T细胞（约80％汇合）与2 µg质粒和500 ng质粒表达Renilla荧光素酶（归一化）。通过共转移2 µg缺乏IRE的荧光素酶（Genscript）和500 ng的质粒表达Renilla荧光素酶（用于归一化）来进行对照实验 。将细胞用胰蛋白酶化并接种到96孔板中（每孔7,000个细胞）
。孵育12小时后，将细胞用媒介物或Myc-ribotac（10 µm）处理指定的时间。根据制造商的说明
，使用双GLO荧光素酶测定系统（Promega，e2920）测量了点击甲虫（使用与萤火虫荧光素酶相同的底物）和Renilla荧光素酶活性 。 　　为了构建一个突变的MYC IRES质粒 ，将小分子结合基序突变为碱基对
，根据制造商的建议，使用了Q5位置定向的诱变试剂盒（NEB ，E0554S）
。用于创建突变体的引物为：5'cgcctctggcgaagccctcccg和5'aagccccccctattcgctcc（IDT）
，其中粗体核苷酸指示点突变。将诱变产物转化为具有化学能力的大肠杆菌（包括在试剂盒中），并使用氨苄青霉素 - 阿古尔板选择 。通过Sanger测序确认突变质粒序列 ，并根据与上述相同的过程在HeLa细胞中测试质粒
。 　　Namalwa Burkitt淋巴瘤细胞（每毫升1,000个细胞
，3 mL）用Myc-CTR（10 µM）或Myc-ribotac（10 µM）处理48小时（单剂量）。然后通过离心在1,000 rpm的情况下通过离心5分钟收集细胞，并将1×103个活细胞重悬于400 µL含有2％（v/v）FBS的IMDM培养基中 。然后将细胞添加到4 mL甲基甲氧化技术（Stemcell Technology ，H4230）中
，并小心地将1.1 mL分布在智能技术中（Stemcell Technology，27370）
。将细胞孵育7-10天 ，并手动计数菌落。 　　NAMALWA（每毫升0.4×106个细胞），HL-60（每毫升0.5×106个细胞
，2 mL）和Raji（每毫升0.7×106个细胞）用车辆，MYC-ribotac（10 µm）或Myc-Ctr（10 µm）的媒介物 ，MYC-ribotac（10 µm）的48小时（SIND）用车辆
，MYC-ribotac（10 µm）或Myc-Crobotac（10 µm）（10 µM）（SING）处理 。为了评估细胞周期的每个阶段的细胞百分比，在室温下用70％（v/v）乙醇掉落1×106细胞 ，然后在-20°C下储存24小时。用1×PBS将固定的细胞洗涤两次
，然后用50 µL的100 µg ml-1 RNase A（Sigma-Aldrich，R-6148）处理5分钟的室温
。然后将细胞用200 µl的50 µg mL -1碘化丙啶染色；Sigma-Aldrich ，P4170）以1×PBS制备。分析染色的细胞在BD LSRII（BD Biosciences）流式细胞仪中分析细胞周期的G1
，S和G2阶段的百分比 。细胞双重组被排除在分析之外
。 　　雌性C57BL/6小鼠（n = 3）用I.P.以1毫克（DMSO：TWEEN-80：H2O的10:10:80 of-MIR-155- ribotac或Mir-155-酰胺激素）治疗一次。注射 。然后在0、15 、30
、60、120 、240、360
、480和1,440分钟以0、15 、30
、60、120 、240
、360、480和1,440分钟收集血浆，以确定血浆中的浓度
。 　　将小鼠饲养在单独通风（IVC） ，带有微隔离器盖的JAG 75笼子中。将HEPA过滤的空气以每h 60的空气交换速度提供到每个笼子中 。将黑暗灯周期设置为08:00（ON）–20：00（OFF）
。温度保持在72±2°F（22.2±1.1°C）。湿度保持在30-70％ 。雌性点头/SCID小鼠（每组n = 8个； 5-7周；杰克逊实验室）进行了乳腺癌研究
，如前所述56，所有研究均由Scripps Research Institute IACUC批准（协议16-025）
。在此方案下允许的最大肿瘤大小为500 mm3或2 cm的直径。 　　简而言之 ，将小鼠静脉注射（尾静脉）与MDA-MB-231-LUC细胞（每只小鼠0.8×106个细胞） 。5天后，复合处理是由荧光素酶活性确定的
，其中平均荧光素酶信号比相邻组织测得的背景高十倍。荧光素酶活性通过i.v.测量每隔一天通过Lagox（光谱仪器）测量每隔一天注射荧光素（每公斤150毫克）
。将小鼠分为两组：媒介物组（DMSO的10:10:80：Tween-80：H2O）或以相同配方中的MIR-155-核能或MIR-155-酰胺前1 mg或1 mg。I.P.交付化合物或车辆每隔一天注射 。 　　30天后，根据美国兽医医学协会提供的指南 ，通过与CO2搭配固定将小鼠安乐死
。对于每组
，将五只小鼠的肺灌注1×PB，并立即固定在Bouin溶液（Sigma-Aldrich ，HT10132-1L）中
，以形象结节。成像后，将肺部切片并用H＆E染色或使用鱼类分析以评估MIR-155之前的水平 。鱼探针和QPCR引物是人类成熟和MIR-155的特异性
。MIR-MIR-155的小鼠具有不同的二级结构 ，缺乏MIR-MIR-155-核糖的结合位点。人和小鼠SOCS1蛋白无法通过可用的抗体区分；因此
，未确定SOCS1蛋白水平 。对于每组的剩余三只小鼠，收集肺并进行快速提取总RNA ，以通过RT – QPCR测量成熟的MIR-155水平
。 　　为了对肺结节进行图像
，将肺固定在60 mL Bouin的溶液中24小时，然后短暂冲洗10％中性的中性福尔马林溶液（Harleco）。计数结节后 ，将肺部用60 ml的10％（v/v）福尔马林溶液洗涤四次（每次洗涤8 h，在室温下轻轻摇动） 。石蜡包裹的切片是由Scripps研究所的组织学核心使用Sakura Tissue-Tek-Tek VIP5 Popaffin处理器生成的
。H＆E染色是在Scripps Research Institute的组织学核心的Leica ST5010自动污渍XL上进行的。 　　为了评估成熟的miR-155水平
，将切片在60°C下孵育15分钟，然后用二甲苯孵育 。在以下每个解决方案中 ，将部分冲洗一次：水中的95％
，80％，50％和0％乙醇。然后将切片在50 mM Tris中用20 µg ML -1蛋白酶K处理 ，pH 7.5
，在37°C下持续10-20分钟，然后在水中冲洗五次
。然后将切片用冰冷的20％（v/v）乙酸处理20 s ，以使细胞透化
，然后用纳米水冲洗3次。通过在100％乙醇中冲洗来使切片脱水 。然后，通过将40％甲酰胺/2×SSC（0.3 m氯化钠和0.03 M柠檬酸钠 ，pH 7.0）缓冲液冲洗切片进行5分钟
，制备切片进行鱼类分析
。然后将载玻片与40％甲酰胺/2×SSC缓冲液一起孵育，其中含有0.2 µM FITC标记的DNA探针（5'-AACCCCCTATCACGATTAGCATTAA） ，2 µg ML-1 BSA，10 nm TRNA（ROCHE
，ROCHE，10109517001） ，用于16 HuniDified Chamber at 37°C
，然后用2×SSC将载玻片冲洗3次，然后用1×DPB冲洗一次 ，然后再添加抗FITC抗体（ABCAM
，6656; 1：500稀释，含1％（v/v）山羊血清（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich））。在室温下孵育2小时后 ，根据制造商的协议
，用DAB底物试剂盒（ABCAM，64238）将载玻片用1×dpbs冲洗3次 ，并使用DAB底物试剂盒（ABCAM
，64238）进行可视化 。使用明亮场显微镜（Leica DM800）获取图像，并使用ImageJ进行定量
。 　　来自其他三只小鼠的肺在-80°C下冷冻 ，并使用组织塑料均匀探针匀浆（Omni International，10062-782）。RNA提取和RT-QPCR分析与上述“ mRNA和PRI-
，PRI-，PER-PRE和成熟的miRNA水平
”部分进行了与上述相同 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。