HIV-1 VIF的结构基础人类Apobec3g

　　HIV-1HXB2 VIF，CBFβ ，ELOB
，ELOB，人A3G的全长基因与C末端-TAG和CULLIN 5截断（1-386;缩写为CUL5N）被Cronice truncection（1-386;缩写为CUL5N） ，以单个Macrobac载体，11A（添加了48294） 。使用BAC-to-BAC杆状病毒表达系统（Thermo Fisher Scientific）60产生了编码所有六种蛋白质的重组杆状病毒
。在SF900 III SFM培养基中
，将SF9昆虫细胞的悬浮液保持在120 rpm和27°C的SHAKER（Innova 4430孵化器振动器）中。将连续稀释的重组杆状病毒添加到25 mL的SF9细胞（2×106细胞ML – 1）中，该细胞在多碳酸盐的erlenmeyer烧瓶（康宁）中生长 ，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳（SDS – PAGE）（SDS – PAGE）评估蛋白质表达
，以使体积的体积供应量表 。用小尺度滴定实验确定的一升SF9昆虫细胞（2×106细胞ML – 1）被病毒感染，并培养48小时 ，然后通过离心（1,500G
，10分钟）收集。Cell pellets were washed with PBS and resuspended in fivefold the pellet volume of lysis buffer (50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 5% glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), mini cOmplete protease inhibitor cocktail（Sigma-Aldrich），25μgml– 1 DNase I（Sigma-Aldrich）和50μgml-1 RNase A（Sigma-Aldrich） ，pH 8.0）
，并通过DOUSE均匀均质溶液
。所有纯化步骤均在4°C下进行。通过在17,000g（F15-8x50Cy转子）下离心2小时，通过离心溶解细胞裂解物 。过滤上清液（0.45μm） ，然后将预先校准的5 mL链球菌HP柱（GE Healthcare）加载到结合缓冲液（50 mM HEPES
，150 mM NaCl，5％甘油 ，1 mm TCEP，pH 8.0）中
。用洗涤缓冲液用15列体积（CV）洗涤柱 （50 mM HEPES
，1.5 M NaCl，5％甘油 ，1 mM TCEP
，pH 8.0），然后是5 cV的结合缓冲液。将蛋白质在补充了5 mM -desthiobiotin（Sigma -Aldrich）的6 CV的结合缓冲液中洗脱 。将洗脱体与1 L透析缓冲液（50 mM HEPES ，75 mM NaCl
，5％甘油，1 mM TCEP ，pH 7.0）相对透析过夜
。将样品应用于用透析缓冲液进行预校准的5-mL HITRAP肝素柱（GE Healthcare）
，并在洗脱缓冲液的0–100％线性梯度（50 mM HEPES，1 M NaCl ，1 M NaCl
，5％甘油，1 mm TCEP ，1 mm TCEP，pH 7.0）上洗脱。将所有六个蛋白质的馏分汇总
，透析透析液（30毫米HEPES，150 mM NaCl ，5％甘油
，1毫米TCEP）至少4小时，并加载到Superose 6增加10/300 GL柱（GE Healthcare）上 ，并与运行的Buffer和0.3 ml frictions预先固定在10/300 GL柱（GE Healthcare）上 。尺寸 - 排斥色谱法表明该粒子是溶液中的二聚体
，该溶液由A3G – VCBC-CUL5N的两个副本组成（大约330 kDa）（扩展数据图1A）
。峰分数直接用于冷冻EM，而无需进一步浓度（扩展数据图1A ，b）。 　　将纯化的复合物（3.5μl
，1.9μμ）施加到发光的超弹型超抗体300元300网格R1.2/1.3网格（电子显微镜科学），在23°C下孵育15 s ，在23°C和100％的湿度下
，用0 s plotter plott plott fe feii fei fei vitrob plott flot for fe fei fei fei fei fei vitrob（在FEI Titan Krios显微镜（Thermo Fisher）上，总共收集了6,429个超分辨率的视频 ，该视频的名义放大倍数为×105,000，配备了K3 Direct Electron探测器和生物化能量过滤器（GATAN）
，并将其设置为20 eV的缝隙宽度 。使用Serialem以8.0 E – Pixel -1 s -1的剂量速率进行半息素进行收集，总剂量在118 frames61上的总剂量为68 e –Å2
。校正剂量分级图像堆栈 ，剂量加权
，并在包装​​scipion62,63中通过MotionCor2通过MotionCor2的物理像素大小为0.835Å。施加了-0.8至-2.0μm的散焦范围 。 　　在CryoSparc v.3.0（参考文献64）中执行了所得求和显微照片的初始处理（扩展数据图1和2A以及扩展数据表1）。通过斑块CTF估算了剂量加权，运动校正显微照片的对比度转移函数（CTF）
。CTF拟合分辨率较差的显微照片大于4Å ，并且去除了过度的冰污染
，导致最终总计6,221位显微照片。选定的显微照片分为两个半数据集，以加快数据处理 。使用CryoSparc圆形斑点挑选了约230万个颗粒 ，最小和最大颗粒直径分别为150和200Å
，并在108Å，提取的颗粒之间的最小分离距离和4 x binned（每个像素为3.34Å）之间
。在对提取的颗粒进行2D分类后 ，丢弃了没有蛋白质特征的类平均值。将其余粒子进行两轮2D分类
，从而产生具有清晰结构特征的类，用于生成良好的初始模型（扩展数据图1C） 。从第一轮2D分类中保存的粒子使用三个参考图（一个良好和两个垃圾）进行了从头开始重建和异质性改进的迭代回合（扩展数据图2A）
。从最佳的重建中重新提取了未连接的颗粒 ，并以不均匀的细化进行了改进。由此产生的三维（3D）地图（指定为“共识重建 ”）具有完善的顶部主体（扩展数据图2A，黑色涂抹框）和相对较差的分辨率（扩展数据图2A
，红色划线框） 。 　　共识重建图的顶部主体显示了可见的螺旋特征，我们能够拟合HIV-1 VCBC（PDB：4N9F）的晶体结构和Alphafold 2预测的人类A3G单体结构（AF2：Q9HC16）31,65（扩展数据图2A ，黑色dash-dash-dash-dash-dashed box）
。为了提高顶部的局部密度
，应用了粒子减法和聚焦精致66。使用Chimera67和Relion68，使用掩模从粒子图像中减去底体的信号 。然后将这些信号提取的颗粒重新放置为冷冻PARC ，并使用顶部的软面膜进行局部细化
。所得聚焦的精制图被称为“单体
”密度图
，因为它以2.7Å的标称分辨率很好地容纳了A3G – VCBC单体结构（扩展数据图2B，绿色框）。密度图的局部分辨率是可变的（图1A ，B和扩展数据图3） 。A3G
，VIF和CBFβ具有良好的侧链密度，可以可靠的模型构建和改进（扩展数据图3）。ELOC和ELOB的分辨率足以用于骨干追踪 ，但是对于Sidechains来说
，大多数密度都没有
。cul5n存在于制备中，但不存在于我们的最终地图中 ，大概是由于VCBC -CUL5N的动态特征或在冷冻15,29期间解离的动态特征。 　　To address the conformational heterogeneity of the bottom body (Extended Data Fig. 2a, red-dashed box), the 495,571 particles from this consensus refinement were subjected to 3D variability analysis in cryoSPARC69 (Extended Data Fig. 2b). Particles were reclassified into six clusters using three principal components with a soft mask enclosing the bottom body and filter resolution set to 8 Å, followed by nonuniform refinement in cryoSPARC. Four out of six selected classes were then imported into RELION and 3D classification was performed without alignment using a T value of 4 to sort remaining low-quality particles. Classes showing strong density for the bottom body were further processed with 3D autorefine in RELION. The reconstructions showed improved densities in the bottom region, in which three distinct conformational states could be identified at a nominal resolution of 3.3 Å (state 1, 57,207 particles), 3.5 Å (state 1′, 51,055 particles) and 3.46 Å (state 2, 48,310 particles), respectively. The two highest-quality maps (states 1 and 2) were refined further, and the resulting maps allowed fitting of an additional copy of the A3G–VCBC complex (Extended Data Figs. 2b and 7). 　　后来在CryoSparc中对状态1进行局部改进，导致重建该区域的密度更完整 。状态2重建在冷冻PARC中进行了进一步的非均匀细化
，以改善各向异性，达到了标称分辨率为3.16Å（扩展数据图2B）
。还通过在Relion66中的重点分类来验证A3G-VCBC二聚体的离散构象状态（扩展数据图4）。从共识重建的粒子图像中减去顶部的密度（扩展数据图4a；红色破折盒突出了要保留的密度） 。这些信号提取的粒子图像使用针对底部身体的软掩码分为六类 ，而无需对齐（扩展数据图4B）
。通过3D自动蛋白进行了细化后
，六个选定类中的四个经过3D分类跳过对准和3D自动填充。所得的3D类与CryoSparc中3D变异性分析生成的类别一致，仅在底部副本的密度水平上有所不同 。我们使用了从3D变异性分析产生的重建图来构建模型 ，因为它们的总密度更强
。最终重建的后处理是为了使用0.143（参考文献70）进行估算
，以估算全局分辨率。用DeepeMhancer71锐化了地图，并通过密度修饰改进 ，而无需在Phenix72中应用地图解释和模型构建模型 。局部分辨率估计是由RESMAP73完成的
。使用3DFSC Server74评估方向分辨率。使用PYEM75进行了软件之间的格式转换 。 　　使用HIV-1 VIFNL4-3CBC – CUL5NTD（PDB代码4N9F）作为模板31的X射线结构
，用Modeller76,77构建了HIV-1 VIFHXB2 –CBFβ的比较模型。HA3G – VHXB2CBC的原子模型是通过将人A3G的单独模型（AF2代码Q9HC16）拟合而成的，即VIFHXB2 -CBFβ和ElOB/C的上述比较模型与SIVRCM VCBC结构（PDB Code 6p59）的MonoMererDff使用UCS6的SIVRCM VCBC结构（PDB代码6p59）
。该起始模型是在COOT78,79中手动重建的 ，并在ISOLDE80中进行了调整以改善本地配件。然后
，该模型在phenix81,82中进行了真实空间 。从单体密度图获得的精制结构用作模型，用于在状态1、1 、1'和2的EM图中构建两个副本 ，以对状态1和2进行相同的模型构建和改进程序，因为它们的总体分辨率较高
，因此对状态1和2进行了
。埋在单体和二聚体中A3G -VIF和A3G – A3G界面处的大多数残基显示了侧链的透明密度，除了状态2的底部副本中VIF残基117-154（扩展数据图3D ，E）。该区域中的弱密度排除了精确的原子建模
，因此仅在一侧可以解释状态2的A3G – VIF二聚体界面 。 　　建立A3G – VCBC蛋白后，我们观察到了状态1和2二聚体的EM地图中的A3G和VIF之间的密度未计数 ，这是由Haruspex（由Anotoral Newural Network）haruspex（Anoveral Newural网络）训练的DNA/RNA/RNA protein in rna/rna versus versus versus versus versus versus maps83 haruspex注释为寡核苷酸
。共生的RNA可能起源于A3G-VCBC共表达的昆虫细胞。连续的磷酸主链密度可以追溯到ssRNA 。清楚地解决了共生的RNA的密度
，尤其是夹在A3G和VIF之间的密度，显示出可以区分嘌呤和嘧啶的特征（图1A – C和扩展数据图3F）
。在RNA的EM密度的指导下 ，手动将含有腺嘌呤或尿苷的虚拟序列手动内置在COOT中的EM图中。Erraser84改善了RNA几何形状 。使用Molprobity85评估了包括RNA在内的完整模型
，并在COOT和PHENIX的迭代细化后进行了优化
。通过近相关系数和Q分数分析86,87评估模型映射拟合。通过Binana88检测到蛋白质 - RNA相互作用，并通过PLIP89和LIGPLOT90与默认设置分析了仅蛋白质的相互作用 ，但氢键键距离截止位置为3.5Å 。使用Pymol91确定状态1和2结构之间的方向和位移。变形视频是在UCSF Chimera X中生成的
。图1A – E
，2A，B ，3以及扩展的数据图。使用Chimera X92创建了3
、7、8 。扩展数据图
。使用Chimera67和Chimera X92生成2 、4。图4是使用Chimera X92和Biorender.com创建的 。模型统计数据在扩展数据表1中总结了
。 　　由于RCMA3G -VIF复合物的原子结构不可用，因此我们使用Modeller v.10.1构建了与VIF -CBFβ结合的RCMA3G的比较模型（参考文献76,77）。对于A3G
，VIF和CBFβ，模板和模型之间的序列身份分别为79、40和100％ 。RNA结合所需的A3G残基是在人类和旧世界猴子中保守的序列（扩展数据图6C）
。将RNA和Zn+2离子的坐标从模板转移到生成的模型。在计算大约600个型号之后 ，我们使用了层次聚类和涂料评分来获得最高得分的群集93 。该集群的精度为1.4Å；模型精度定义为结构模型之间的可变性
。得分最佳的模型用于进一步分析
，并在扩展数据中显示了图6b。 　　我们使用模型赛，计算了与Neddypated CRL5和辅酶ARIH2复合物中完整A3G -VIF -CBFβ的比较模型 。模板包括此处介绍的A3G – VIF –CBFβ -ELOB/C结构 ，即VIF –CBFβ– Cul5ntd -Elob/C五型聚体络合物（PDB代码4N9F）31
，Neddydypated Cul5CTD – RBX2 – RBX2 – RBX2 – Arih2 ariH2 tetrameric complace（pdb codle）（PDB Codle 7Oni）和一个结构结构，并构成了一部分结构。CUL1 – RBX1 – UB – ARIH1（PDB代码7B5M）52
。我们计算了大约100个模型 ，这些型号通过涂料评分93进行了聚类和评估。最高得分群的精度为1.6Å 。得分最高的模型用于进一步分析
，如图3A所示
。 　　我们在HIV-1 LAI VIF基因中使用退化寡核苷酸诱变在位置22
、23、26和40的位置生成了一个变体库。将单个菌落测序并连接到慢病毒载体中 。人类A3G在PCDNA4/到矢量骨架上的C末端3XFLAG表位标签（Thermo Fisher，No
。V102020）被转染到HEK293T细胞中（ATCC CRL-3216（ATCC CRL-3216）（未经认可 ，定期测试
，定期测试过mycoplasma污染物），在六季度中均匀均匀均匀。1.5×105个细胞ML – 1 。通过共转染1,000 ng的VIF载体 ，200 ng的A3G-3XFLAG和500 ng的PSPAX2，用Transit-LT1转染试剂（Mirus
，no
。Mir2304）在3：1的质子dna Ratio中分析了A3G的量。转染两天后，通过0.2μm注射器过滤器过滤1 mL上清液 ，并在Eppindorf 5415R桌面微量离心机中颗粒4°C
，在4°C和最大速度下进行1 h 。将上清液取出，并将25μl的Nupage 4×载荷染料（Invitrogenno
。NP0007）添加到每个样品中。在95°C下将样品煮沸10分钟 ，并在SDS -PAGE凝胶上加载 。抗flag（Sigma
，No。F3164）和抗P24GAG（NIH-ARP，第3537号）抗体用于以1：5,000的稀释为免疫印迹
。小鼠IgG HRP偶联抗体（R＆D Systems ，No。Haf007）用于以1：5,000的稀释度检测主要抗体 。使用ChemidoCMP成像系统（Bio-RAD）对所有免疫印迹的化学发光信号进行成像
，并使用ImageJ软件处理图像，以量化每个检测到的抗体带的光密度测定法
。通过将A3G的量除以P24GAG的A3G归一化A3G ，并将该数字设置为“无VIF”控制的1.0。 　　为了分析与RNA和A3G相互作用位点在VIF中的自然变化
，从Los Alamos HIV数据库（https://wwwww.hiv.lanl.gov.gov/content/content/index）下载了HIV-1和SIVCPZ序列的策划亚型参考对准 。该比对包括来自每个HIV-1组M亚型的四名代表，以及N组 ，O和P组的四个，以及来自每个PAN troglodytes subspecies（Troglodytes和Schweinfurthii）的21个SIVCPZ序列
，这些序列是从主要分离株中全面涵盖该地理位置范围的
。SIVASC，SIVDEB ，SIVDRL
，SIVLST，SIVGSN ，SIVMAC
，SIVMAC，SIVMUS ，SIVRCM
，SIVRCM，SIVSMM ，SIVGRV
，SIVGRV，SIVVER ，SIVTAN，SIVTAN
，SIVSUN，SIVSAB和SIVGOR的共识序列是从每个在每个siv中的所有可用序列中生成的。这些序列是使用Clustal Omega对齐的 ，并从WebLogo95的这些比对生成徽标图 。 　　要生成A3G序列对齐
，从NCBI下载了序列（登录号AGI04219.1，AAP85255.1 ，Q694C1.1
，age34499.1，NP_001332845.1Age34487.1 ，Any26448.1
，XP_011710628.1，AGX93019.1 ，XP_011710628.1
，AEY75956.1，NP_001279005.2 ，AEY75955.1，Q7YR25.1）
。将序列与Clustal Omega对齐
，并使用ESPRIPT 3（参考文献96）进行可视化。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。