人肝脏再生的多模式解码

　　从苏格兰“ A”研究与伦理委员会（16/SS/0136）和NRS Bioresource和Tissue治理单位（研究编号SR574）（研究编号SR574）（SCOTLAND SCOTLAND REANCEENT ETYETS SERVICS（参考）研究Ethics Service 15/Es/es/es/es/es/es/es ，从苏格兰研究编号SR574（Scotland Eastland Researtion Ethics Service every of Scotland servance corvience）（参见15/ES/ES/ES/ES/ES
，从而，用于采购用于SnRNA-SEQ ，空间转录组学和组织学分析的人肝组织的局部批准 。根据本地方法规，在入学之前
，已获得参与者或合法授权代表的书面知情同意
。ALF肝组织是从爱丁堡皇家医务室的苏格兰肝移植单元的正常肝移植的患者术中获得的。在补充表1中总结了患者的人口统计学，该患者针对APAP诱导的ALF和非A-E ALF的患者进行了总结 。从接受手术肝切除术的患者术中 ，在爱丁堡皇家医务室临床手术系术中
，接受了术中术中术中术中术中术中获得了健康的肝组织。慢性肝病，异常肝功能检查或过去4个月内接受全身化疗的患者被排除在该队列中
。为了评估人ALF和慢性肝病组织的组织学评估 ，Lothian NRS NRS人类注释的生物库提供了匿名化的未染色的福尔马林固定
，石蜡包埋的肝组织切片的肝脏组织切片，从苏格兰东部的授权下 ，苏格兰东部研究伦理学服务Rec 1（参考文献15/ES/eS/0094）。 　　1998年成立了美国肝脏中心的急性肝衰竭研究组（ALFSG）联盟
，以更好地定义急性肝损伤和ALF的结果 。该研究方案得到了参与地点的当地机构审查委员会的批准：德克萨斯大学西南医学中心；德克萨斯州达拉斯的贝勒大学医学中心；南卡罗来纳州医科大学，南卡罗来纳州查尔斯顿；华盛顿大学西雅图 ，华盛顿大学；华盛顿大学
，密苏里州圣路易斯；加利福尼亚大学，旧金山大学和加利福尼亚州旧金山的加利福尼亚太平洋医学中心；内布拉斯加州奥马哈市内布拉斯加州大学；西奈山医学中心和纽约州纽约的哥伦比亚大学医学中心；明尼苏达州罗切斯特的梅奥诊所；宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学；伊利诺伊州芝加哥西北大学；俄勒冈州健康科学中心 ，波特兰，俄勒冈州；加利福尼亚大学
，加利福尼亚大学；密歇根大学，密歇根州安阿伯；耶鲁大学 ，康涅狄格州纽黑文；阿拉巴马大学
，伯明翰，阿拉巴马州；马萨诸塞州波士顿的马萨诸塞州综合医院；北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学；亚利桑那州斯科茨代尔的梅奥诊所；宾夕法尼亚州费城的阿尔伯特·爱因斯坦医学中心和宾夕法尼亚大学；弗吉尼亚州里士满弗吉尼亚联邦大学；加利福尼亚大学加利福尼亚大学；佛罗里达州杰克逊维尔的梅奥诊所；加利福尼亚大学加利福尼亚大学加利福尼亚大学；俄亥俄州立大学 ，俄亥俄州哥伦布；堪萨斯城堪萨斯城
，堪萨斯州堪萨斯州；佐治亚州亚特兰大埃默里大学；艾伯塔大学，加拿大埃德蒙顿
。根据本地方法规 ，在入学之前
，已获得参与者或合法授权代表的书面知情同意。地点获得了一部分新鲜的外植物肝组织切成1 cm3块，放入单个冰冷的碎片中 ，并保存在-80°C下
，直到被要求进行研究 。ALFSG得到了美国国家糖尿病和消化研究所和肾脏疾病的支持（NIDDK； GrantNo
。U -01-58369）。本研究中使用的样品由NIDDK中央存储库提供 。本文不一定反映NIDDK中央存储库或NIDDK的意见或观点
。 　　在北爱尔兰研究伦理委员会卫生与社会护理研究伦理委员会A卫生和社会护理研究伦理委员会A的批准下，在英国剑桥市Addenbrooke医院招募患者 ，北爱尔兰（ORECNI）（ORECNI）（16/NI/0196和20/NI/0109）。根据本地方法规，在入学之前
，已获得参与者或合法授权代表的书面知情同意 。移植时，来自ALF患者的肝组织来自外植的肝脏
。所有组织样品均在液氮中捕集 ，并在剑桥大学医院NHS基金会基金会的人类研究组织库中储存在-80°C。 　　从英国伯明翰伯明翰大学获得的人肝组织获得了英国伯明翰的批准（参考文献06/Q2708/11
，06/Q2702/61），并获得了书面知情同意 ，从参与者或在本地批准之前获得合法授权的代表 。肝组织是从伯明翰女王伊丽莎白医院接受原位肝移植的患者的外植物肝脏中获得的。所有组织样品均在液氮中捕集
，并在-80°C下储存，然后由伯明翰人类生物材料资源中心处理和运输（参考09/H1010/75; 18-319）
。 　　根据当地伦理批准获得了从英国伦敦大学获得的人肝组织（伦敦 - 汉普斯特德研究伦理委员会；参考文献07/Q0501/50）。根据本地方法规 ，在入学之前
，已获得参与者或合法授权代表的书面知情同意 。肝组织（福尔马林固定，石蜡包埋）是通过急性严重肝损伤的患者的经卵线肝活检获得的；这些患者自发康复而没有肝移植
。 　　用于所有实验的小鼠均为8-12周龄 ，并在传统的隔离单元设施中安装
，具有传统床上用品，12-12-H的光线 - 黑色周期 ，环境温度控制（21°C；湿度为40-60％），在爱丁堡大学的无病因条件下
，可以使用食品和水。除非在图传说中另有描述，否则将雄性小鼠用于所有实验 。年龄和性别匹配的小鼠被随机分配到治疗组
。对组织样品的起源视而不见。进行免疫荧光染色的研究人员 ，单核RNA-SEQ和RT-QPCR与收集组织的研究者不同 。IVM研究没有盲目
。所有实验方案均由爱丁堡大学动物福利和道德委员会批准
，并根据英国内政部法规。C57BL/6JCRL小鼠是从Charles River Laboratories（英国）获得的 。MTMG（JAX 007676; B6.129（CG）-GT（ROSA）26SORTM4（ACTB-TDTOMATO，-EGFP）LUO/J）LUO/J）32和TDTOMATO（JAX 007914; JAX 007914; B6.CG-GT（ROSA）26sortm14（rosa）26sortm14（cag-tdtttttttttttttttmate）实验室
。对于APAP诱导的急性肝损伤模型 ，在腹膜内注射300 mg kg-1（雄性）或350 mg kg-1（雌性）的APAP之前
，小鼠在无菌PBS中的APAP中禁食12小时，如前所述34。如前所述35 ，诱导急性和慢性CCL4诱导的肝损伤 。对于胆管连接小鼠
，用异氟烷麻醉，并通过手术结扎了常见的胆管。术后通过皮下注射术在术后施用丁丙诺啡疼痛 ，并在25°C的过程中保持动物
。对于DDC（3,5-二氧基碳酸-1,4-二氢核苷）饮食诱导的胆汁淤积性肝损伤
，给出了21天的0.1％DDC与正常的Chow（特殊饮食服务）混合了21天。 　　For hepatocyte-specific AAV8-Cre-mediated reporter gene induction, stock AAV8.TBG.PI.Cre.rBG (AAV8-TBG-Cre; a gift from J. M. Wilson (plasmid #107787, Addgene); stored at −80 °C) was thawed on ice, diluted in sterile PBS to achieve a working titre of 2 × 1012 genetic每毫升副本，随后存储在-20°C下直至使用 。在注射当天 ，将稀释的AAV解冻，并通过尾静脉注入100μl（每只小鼠2×1011遗传拷贝）36
。在APAP引起的急性肝损伤之前
，将小鼠持续1周。对于对ANXA2的体内肝细胞特异性敲低，将小鼠静脉注射为1×1012个遗传拷贝 ，每毫升AAV8-GFP-U6-Manxa2-ShRNA（Shanxa2）或AAV8-GFP-u6-u6-u6-u6-u6-scrmb-scrmb-shrna（shanxa2）和ap-ap-ap-ap-apind-apind-apind-laffore 。为了在饮用水中施用BRDU
，将BRDU溶于饮用水中，浓度为0.8 mg ml -1
。 　　如先前使用TST Method37所述 ，对SNRNA-SEQ进行的人和小鼠肝脏进行了处理。每个时间点对N = 3小鼠进行小鼠肝核分离
，并合并核以用于SNRNA-SEQ 。 　　根据制造商的协议，使用铬单细胞3'库通过10倍基因组铬平台处理单核和使用铬单细胞3'库和凝胶珠套件V3（PN-1000075 ，10x基因组学）和铬单细胞B芯片试剂盒（PN-1000074
，10X基因组学）根据制造商的协议以及前面所述
。在Illumina Hiseq 4000或Novaseq 6000上对图书馆进行了测序。 　　将未固定的肝组织嵌入到组织TEK（OCT）和froz片中 。然后将样品冷冻（10 µm）放置在预冰（10倍基因组学）组织优化载玻片或空间基因表达载玻片上
。斑点尺寸为55 µm，斑点质体之间的斑点尺寸为100 µm。根据制造商的规程处理组织切片 。根据优化时间过程实验 ，将组织透化18分钟。 　　将未固定的快速肝组织冷冻（10 µm）到分辨生物科学载玻片上
，并在干冰上发送以解决生物科学进行加工
。使用分辨生物科学专有设计算法设计基因探针。补充表6中提供了探针细节 。在示例成像，点分割 ，预处理以及信号分割和解码之后，在R编程语言v3.4.1中进行了最终图像分析
。 　　使用发现（相干）的“多光子 ”激光器通过将水滴放在盖玻片的顶部
，通过×20 vis- Ir校正的水浸入物镜（NA 1.0）进行单彩TDTOMATO成像。使用相同的设置进行了双色EGFP – TDTOMATO成像，并调谐到1,000 nm 。使用非研究的GAASP检测器（GFP NDD滤波器BP 500-550 nm； TDTOMATO NDD滤波器BP 575–610 nm）最初获得概述图像 ，然后选择三个中央静脉场进行及时的脉络性图像
。然后将这三个场作为Z堆栈（40–50 µm）成像
，每10分钟6小时。用异氟烷（4％诱导，1-1.5％维持）在施用APAP（350 mg kg -1）之后 ，在大约95％的氧气（0.8 L min -1）中
，由氧气清道夫（Vettech）产生 。将肝脏上方的外套剪断，将曲杆底涂在眼睛上 ，然后将小鼠放在直立的LSM 880 NLO多光子显微镜（Zeiss）上的加热阶段的背侧位置
。进行了腹部切口
，暴露了肝脏的表面；然后，使用定制的盖玻片成像真空稳定电枢稳定下来。将最温和的真空吸尘器与肝脏接触到表面上 ，将其固定在盖玻片上 。成像期间
，小鼠每45分钟接受每45分钟的皮下液
。在成像疗程结束时，小鼠在全身麻醉下因宫颈脱位而杀死小鼠。 　　使用IMARIS 9.7（BITPLANE）进行了及时的图像分析和可视化 。Imaris的“参考框架
”首先用于校正XYZ漂移。为了创建伤口的4D渲染 ，使用高斯滤波器将肝细胞通道倒并平滑
。然后，使用Imaris“表面”工具来创建与伤口相对应的表面。然后将对象统计数据导出以分析表面体积随时间的演变（表示为初始体积的百分比） 。为了创建来自MTMG小鼠的单个肝细胞的4D渲染
，首先在Google Drive中导入注册图像，在线平台ZerocostDL4MIC38用于在EGFP（HEPATOCYTES）通道上执行CellPose Semmentation39
。使用“标签到ROI ”插件在ImageJ中处理细胞蛋白注销的图像 ，以创建侵蚀的感兴趣区域（ROI）
，然后是“ ROI”插件的“掩码
”插件来产生细胞口罩。为了减少非特异性分割，使用iMaris中的“通道算术”工具从掩模通道中阈值TDTOMATO信号 。然后 ，使用Imaris“表面 ”工具来创建与肝细胞相对应的表面
。然后
，将细胞统计数据导出以根据其与伤口的关系（与伤口的距离）分析形态动力学参数。使用轨道长度和速度（表明细胞迁移率）以及细胞球形和椭圆度的标准偏差（表明细胞形状随时间变化）确定细胞行为 。 　　免疫组织化学和免疫荧光染色是对福尔马林固定的，石蜡包裹的肝组织切片（4 µM）进行的
。使用Leica Bond RXM自动机器人染色系统将载玻片脱蜡和免疫荧光标记。与热施用结合使用键表位置检索溶液1或2进行20分钟进行抗原检索 。然后将切片与在含有PBS的0.1％Triton-X中稀释的原代抗体一起孵育
。将切片用DAPI（Sigma）染色 ，并将其安装在玻璃盖板上
，以延长的金抗固定培养基，并在4°C下储存直至成像。对于体外EDU检测 ，将细胞在PBS中洗涤
，然后在室温下用4％甲醛溶液在PBS中固定10分钟，然后根据制造商的方案对细胞进行染色 。Troma-III由R. Kemler（DSHB杂交瘤产物Troma-III）沉积到DSHB。补充表6中包含抗体和条件的完整列表
。 　　使用蔡司公理Z1扫描载玻片。使用Zen Blue软件（v2.6）处理图像 。对于体外免疫细胞化学 ，使用EVOS FL自动成像系统对井进行了成像
。所有图像分析均在Qupath（v0.3.0）41中进行，带有明星核检测扩展42。 　　使用补充有10％FBS和2 mM-谷氨酰胺的RPMI 1640培养人类永生化的肝细胞细胞系（Hu -7; 300156
，细胞系服务） 。使用商业提供商测试的STR分析和支原体对HUH-7细胞进行身份验证
。如前所述43，将原发性小鼠肝细胞分离并培养。 　　使用siRNA进行HUH7和原代小鼠肝细胞的基因敲低 。将细胞以每毫升500,000个细胞（Huh7 ，Corning Costar；原发性小鼠肝细胞
，Corning Primaria）的形式铺板，然后将血清饥饿过夜（在没有FBS的培养基中）
。根据制造商的建议 ，用lipofectamine rnaimax转染试剂进行siRNA双链体
，以50 nm的浓度使用。在含有2％FBS的无抗生素培养基中，将细胞暴露于双链体中48小时 。将细胞用于RNA和RT -QPCR
。通过RT – QPCR评估基因敲低效率。用对照siRNA（1027280 ，QIAGEN）
，siRNA用于ANXA2（人，HS_ANXA2_8 ，SI02632385
，QIAGEN）或siRNA的细胞处理Anxa2（Mouse，MM_ANXA2_3 ，SI00167496，QIAGEN） 。 　　使用incucyte系统（Essen Bioscience）进行刮擦伤口测定法。将HuH7细胞铺在incucyte Imagelock板（Essen Bioscience）中
，并将其视为上面的Anxa2基因敲低
。然后，使用incucyte伤口制造商伤害了子共同的单层。为了获得用于伤口测定的原代小鼠肝细胞的汇合单层 ，将细胞如前所述44
，并进行修饰 。简而言之，将三个单独的每毫升500,000个细胞播种到胶原蛋白I涂层的Incucyte Imucyte板上 ，以2小时的间隔
。在加热PBS的添加剂之间除去非粘附的肝细胞。然后使用incucyte伤口制造商在损伤之前将细胞如上所述
，用于基因敲低 。受伤后，在整个测定过程中添加了人类HGF（100 ng ml -1） ，将细胞保持在完整的培养基中
，并将细胞保持在整个培养基中
。在测定结束前24小时，将EDU（10 µM）添加到培养基中 ，以评估增殖。为了分析伤口愈合
，使用了用于incucyte变焦的刮擦伤口插件 。所有实验均作为四倍技术重复进行；图图中指定了独立实验的数量
。 　　如上所述，将原发性小鼠肝细胞从未受伤的肝脏中分离出来 ，并将其镀入六孔的原板板（康宁）。肝细胞像以前一样对Anxa2敲低的治疗，并使用10 mM APAP在敲低后48小时诱导肝细胞死亡 。然后将SCRMB-SIRNA（对照）或Anxa2-SiRNA处理的死肝细胞用于体外吞噬作用测定
。从股骨小鼠中分离出骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）
，并在培养中分化了7天，并添加了104 U ML-1 CSF1。分化后 ，将BMDMS以每个井的250,000个细胞将24孔板放入24孔板中
，并在一夜之间培养 。第二天，用cypher5e NHS酯（PA15401）在室温下在黑暗中培养死肝细胞10分钟 ，然后在PBS中洗涤3次
，然后将其涂在BMDMS上。然后将Cypher5E染色的死肝细胞在37°C下用BMDMS培养1.5 h
。然后，通过使用PBS急剧清洗3次 ，将非生殖的肝细胞清除
，并使用残留的粘附BMDM进行后续分析。为了进行流式细胞仪分析，用F4/80（123141 ，Biolegend;在4°C
，1：100）中染色BMDM，并在获得样品之前立即进行细胞活力染色（DAPI; 1：1,000） 。使用BD FACS Diva软件对BD LSR Fortessa流式细胞仪（Becton Dickinson）进行了数据采集 ，并使用FlowJo 10.9.0软件分析了数据
。补充表6概述了门控策略。 　　使用RNeasy Plus Micro Kit从原代小鼠肝细胞和HUH-7细胞中提取RNA，并根据制造商的协议（QIAGEN）使用定量逆转录套件进行cDNA合成 。反应以384孔板格式一式三份进行
。使用Powerup Sybr Green Master Mix进行RT -QPCR。补充表6中详细介绍了引物 。样品在ABI QuantStudio 5上放大（Applied Biosystems
，Thermo Fisher Scientific）
。使用GAPDH/GAPDH进行归一化的2-ΔΔCT定量方法用于估计样品中的靶mRNA量，并计算出相对于对照样品中平均mRNA表达水平的表达。 　　分析了四个计算数据集：（1）来自健康（n = 9） ，APAP-ALF（n = 10）和NAE-ALF（n = 12）肝的72,262人核；（2）来自APAP诱导的急性肝损伤时间的59,051小鼠核；（3）来自人肝的空间转录组（n = 3健康
，n = 2 APAP-ALF和n = 2 NAE-ALF）和小鼠肝脏（每个时间点n = 1）；（4）来自人肝脏的多重纹章​​（n = 2健康，n = 2 apap-alf） 。 　　我们使用CellRanger v3.1.0单细胞软件SUITE ，与10x基因组中的CellRanger v3.1.0单细胞软件SUITE相符
，与GRCH38和MM10（ENSEMBL 93）参考基因组（修改以允许内含子和外观特征对齐）以及估计的含核的分区和唯一的分子标识符（UMIS）
。在R编程语言v3.4.1中进行了进一步的分析。 　　为了启用可重复的分析，我们开发了SeuratPipe R软件包v1.0.0（https://doi.org/10.5281/zenodo.7331092） ，这是现有软件包的管道建设 。简而言之
，我们进行了如下分析：我们在Seurat45 R软件包v4.1.1中进行了人均质量控制。我们使用scrublet46 Python模块V0.2.3识别潜在的双线仪和Soupx47 R软件包v1.5.2来自动计算并正确纠正背景污染
。最后，我们排除了表达少于1,000个基因的核 ，即超过总UMI计数的5％以上的线粒体基因含量。 　　合并了单个数据集后
，我们通过将该核的总UMI计数分配，然后将其乘以10,000的比例因子和自然神经转化 ，将每个核的特征计数归一化 。我们通过使用Harmony48 R软件包v0.1.0获得主成分嵌入来纠正样品偏差
。此外，我们对肝细胞种群进行了缩减
，以标准化对下游分析的样本贡献。 　　使用在Seurat中实现的基于共享的基于基于和谐校正的主组件实现的共享最近的邻居模块化算法来鉴定核簇，以构建共享最近的邻居图 。我们使用Wilcoxon Rank-sum测试计算了差异表达的特征
。为了注释这些簇 ，我们使用了肝脏中每个细胞谱系的已知标记基因的策划列表（补充表2）
，以使用Seurat中的AddModulesCore函数获得签名分数。将主要由循环细胞组成的集群重新聚集，将其分成其组成谱系 ，如上所述 。然后
，我们迭代地应用了上述工作流程为每个谱系的识别，插入了一个“清洁
”步骤 ，在该步骤中
，我们删除了簇，显示了以前识别为Doubles或其他谱系过表达的标记基因的大量核
。我们使用前25名（通过AVG_LOG2FC）从人类迁移的肝细胞簇中生成了肝细胞迁移基因模块（补充表2）。使用ClusterProfiler49 R软件包v4.8.3进行GO分析 。通过将中央和门户的分区签名分数首先缩放到0到1之间 ，从而获得了肝分区特异性得分
，然后设置分区得分=中心分数/（中央分数+门户网站分数）
。当绘制感兴趣的特征时，我们应用了分位数阈值。 　　为了确定APAP-ALF数据中年龄和性别的任何混杂作用 ，在感兴趣的变量和和谐组件之间进行了Pearson和点 - 生物相关性 。 　　在Scanpy50 Python模块V1.9中生成扩散图和力指导的图。细胞周期效应在以下维度降低之前进行了回归
。根据使用和谐组件在扫描仪中重新计算的邻域图编制了扩散图。随后使用扩散图坐标对该邻域进行了剥离，并用作基于分区的图形抽象的输入以及相关的sublineage注释 。基于分区的图形抽象又用于初始化力指向图的计算
。 　　使用默认参数的CellChat51 R软件包v1.6.1对人APAP-ALF和鼠标APAP诱导的肝损伤数据集进行了Interactome分析。在执行分析之前
，将每个单个血统的注释映射回包含所有谱系的数据集 。 　　我们使用Spaceranger v1.0.0的GRCH38和MM10（ENSEMBL 93）参考基因组对齐10倍基因组学的空间基因表达软件套件
。在R编程语言v3.4.1中进行了进一步的分析。 　　我们在Seurat R软件包v4.1.1中进行了人均质量控制 。我们排除了总UMI计数的人和小鼠样品的斑点，其表达少于800个基因或线粒体基因含量超过20％
。我们还使用10倍基因组Loupe浏览器（V5.0）手动过滤低质量斑点（从主组织段分离的斑点（从主组织段分离的斑点）。与SNRNA-SEQ相似 ，我们计算了肝细胞（TTR
，TF，HP ，CYP2A6
，CYP2E1，CYP2E1 ，CYP3A4和HAL）
，肌纤维细胞（ACTA2，COL1A1 ，COL1A1
，COL1A2，COL1A2和COL3A1和COL3A1）和Cycling细胞（Genes ins seuratsccccccccccccc.gen.gen.gen.gen）的基因签名分数 。当绘制感兴趣的特征时 ，我们应用了分位数阈值
。 　　基因表达和组织地形用于通过SPATA2（参考文献52）R封装V0.1.0跨健康和APAP-ALF组织绘制空间轨迹。SPATA2的轨迹建模功能用于鉴定与中央相关的基因和相关的基因以及相应的模块（补充表2），其表达轨迹遵循了基本的空间模型 。 　　使用Qupath进行核分割和扩张来划分细胞。然后获得基因 - 细胞基质
，应用质量控制和归一化，并使用预定义的细胞种群计算组织中的特征评分
。 　　使用GraphPad Prism进行了进一步的统计分析。使用两尾配对的学生的t检验或未配对的学生的t检验对两组之间的变化进行比较 。使用双向方差分析和Sidaks多重比较测试和单个差异进行了组之间的变化比较
。Pearson的相关系数（R）用于测量变量之间的关系。p <0.05被认为具有统计学意义 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。