转录开关控制恶性疟原虫中的性别确定

　　Parasites (NF54) were cultured in O− or A− whole blood obtained from the Etablissement Français du sang (21PLER2020-004), in RPMI 1640 culture medium (Gibco) supplemented with 2 g l−1 glucose (Sigma), 2 g l−1 sodium bicarbonate (Sigma), 10 mg l−1 hypoxanthine (Sigma),50 mg ml-1庆大霉素（Gibco） ，0.5％COLLEAX-II（GIBCO）和5％AB+人血清（21PLER202020202020-004）
，并在含有5％O2 、5％CO2和90％N2的气态环境中保持在37°C。通过使用相同的完整培养基和标准的配子细胞培养方法获得性阶段25 。通过在培养基中加入20 U ML -1肝素钠盐（Sigma）处理，从培养物中除去污染的无性形式
。在单细胞RNA-seq中使用的时间课程中 ，异步寄生虫培养物的种植量达到4-7％
，此时只有三分之二的媒体被新鲜的媒体取代。在这种压力后的一天，添加肝素以防止进一步的侵袭 ，并在应力后第3
、5、7和9对寄生虫进行采样
，以覆盖广泛的Gogatocyte发育，而不会过多污染无性无性恋 。对于成熟测定 ，还使用了肝素，并且在压力后每天从第4天开始对配子细胞进行评分
。在GIEMSA染色的薄血涂片上评估和量化了配子细胞的成熟度。对于外氟化测定
，将V期配子细胞放入RPMI中，其血清和100 µM黄脑酸（Sigma）（Sigma） ，并在激活后的15到30分钟内建立了外氟化中心的数量 。通过使用红细胞（RBC）密度以及每种培养的配子细胞血症（V阶段V）计算出外氟化率
，并将其标准化为WT
。为了跟踪性别确定期间寄生虫的生存能力，用肝素治疗的WT ，KO和Δ270-699的同步配子细胞培养在压力后的第2天到第6天
，每24小时每24小时随后遵循上述。配子细胞用Vybrant Green染色（1:10，RPMI ，Thermo Fisher）和300 nm Mitotracker深红色（Thermo Fisher）在RPMI培养物中30分钟
，在37°C中稀释30分钟 。用非寄生的RBC制备了用Mitotracker Deep Red和Vybrant Green制备未染色的对照和染色对照，以建立两个荧光染料的负群体。孵育后 ，将样品洗涤两次
，重悬于200 µL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并通过BD FACSDIVA软件（v.9.0.1）在LSRFORTESSA流式细胞仪（BD Biosciences）上通过流式细胞仪分析
。Vybrant绿色被蓝色激光激发 ，并由530/30滤波器检测到，而Mitotracker深红色被红色激光器激发
，并被650/10的滤波器检测到。每个样本收集了500,000个事件 。测量了Vybrant阳性寄生虫之间的Mitotracker深红色阳性配子细胞的百分比
。用FlowJo v.10.7（树星）分析收集的数据。在补充图1中显示了门控策略 。对于MD1表达的时间过程，用肝素治疗的MD1-2A-GFP同步培养在压力后的第0天到第8天 ，每24小时每24小时遵循以上的同步培养
。每天
，用HOECHST 33342染色（RPMI中的1：10,000稀释； Sigma），并在Zeiss Axiolmager Z2上评估了1,000 Hoechst阳性寄生虫的GFP表达。在100个HOECHST阳性细胞上建立了明亮的GFP阳性配子细胞阶段的比例 。 　　通过将大约5％的环形感染的RBC电膜转染恶性疟原虫（NF54）寄生虫 ，总计为50μg圆形质粒
，如前所述27
。电穿孔后，在搅拌下生长转基因寄生虫（50 rpm） ，并使用适当的药物选择。在光显微镜下
，通过GIEMSA染色的薄血涂片来监测抗性寄生虫的生长 。连续选择2.5 µM blasticidin（Invitrogen）连续选择表达转基因（KO互补，过表达FL和NT）的突变线
。突变线KO ，Δ270-699
，MD1-2A-GFP，MD1-3XHA ，MD1-Turboid和ΔInt1选择2.5 nm的WR99210（来自Jacobus Pharmaceuticals）10天，随后在不进行药物选择的情况下生长。在没有药物压力的情况下
，通过限制稀释剂来衍生出克隆 。对于每次转染，通过PCR筛选混合种群和克隆 ，以进行正确的整合和缺乏WT基因座。 　　通过使用核素素血试剂盒（Macherey Nagel）提取所有克隆反应中使用的基因组DNA
。在提取之前
，将高度寄生的恶性疟原虫培养物（NF54）的红细胞裂解在PBS中0.1％皂苷（Sigma）的溶液中裂解，在冰​​上进行5分钟 ，寄生虫通过中心分解（3,600g
，4°C，5分钟）收获。通过使用KAPA HIFI聚合酶（Roche）进行PCR反应 ，并按照制造商的说明
，使用GOTAQ DNA聚合酶（Promega）进行菌落筛选 。首先在37°C下用T4 PNK磷酸化用于克隆SGRNA序列的退火寡核苷酸，然后使用T4 DNA Ligase（使用T4 DNA Ligase（使用T4 DNA Ligase）（在16°C的过夜）进行BBSI消化后 ，将其克隆到PDC2-CAS9-CAS9-CAS9-CAS9-CAS9-HDHFR-YFCU质虫28中
。所有限制酶
，T4 DNA连接酶和T4 PNK均购自NEB。准备了15种不同的质粒来研究MD1的功能（PF3D7_1438800）： 　　为了通过双重交叉同源重组事件完全消除基因，设计了两个供体序列 ，以针对起始密码子（同源区域1; HR1）和终止密码子（同源区2; HR2）上游的区域 。Homology regions were amplified from genomic DNA with primer pairs 202/203 (522 bp) and 116/117 (554 bp), respectively, and sequentially inserted into the plasmid pLN-HAx3 by In-Fusion HD cloning (Clonetech) following digestion with AvrII and EcoRV (HR1) or AflII and BamHI (HR2).通过使用https://zlab.bio/guide-design-resources29和SGRNA（退火引物G33/g34）在https://zlab.bio/guide-design-resources29中选择的靶向基因5'端的SGRNA被克隆到PDC2-CAS9-Cas9-Cas9-HDHFR-YFCU-YFCU质粒中
。所得的寄生虫线称为KO，其中删除了整个MD1开放式阅读框（ORF）
，而无需集成电阻盒。 　　KO的互补是通过完整MD1 ORF的偶发表达进行的，其推定启动子区域的1,538 bp 。通过使用引物209/210（1,538 bp）从基因组DNA放大启动子 ，并通过融合HD克隆（用ApaI和Avrii（HR1）消化）将其克隆到PLN-HAX3中
。该中间质粒命名为PLN-MD1PROM-HAX3-INTERMEDITE。接下来
，使用AS IV/V Gametocyte互补DNA（cDNA）（见下文）和引物211/208（2,100 bp）扩增FL ORF 。将其克隆到PLN-MD1PROM-HAX3-INTERMITE中，被AVRII和NAEI通过融合HD克隆消化
。 　　使用了不同的基因干扰策略来生成突变线Δ270–699。在这种情况下 ，设计了两个供体序列
，以使用底漆287/288（HR1，505 bp）和引物为289/290（HR2 ，474 bp）的第四个外显子来靶向第一个外显子的末端 。将这些产物依次克隆到质粒PDC2-U6-Cas9-HDHFR30中
，并在用AATII和ECORI（HR1）和APAI（HR2）消化后具有Gibson装配策略。将每个HRS插入质粒中存在的耐药性盒（HDHFR）的任一侧，可确保转染后后者在寄生虫的基因组中的整合
。通过使用退火引物G92/G93将靶向第四外显子开始的SGRNA序列克隆到同一质粒中。鉴于Δ270-699突变体的意外表型 ，我们评估了破坏基因座的编码潜力 。通过双交叉同源重组整合质粒后
，外显子1的第一个808 bp（在总计1,006 bp中）仍然不受干扰
。在修饰的基因座中，MD1基因的这一段之后是20 bp的质粒序列 ，终止密码子和反向链中编码的电阻基因盒的3'非翻译区域。在基因3'端的其余476 bp中，缺乏启动子和产生六个终止密码子的移料器消除了其编码潜力 。结果
，在δ270-699突变体中，我们期望第一个外显子的第一个269 AA的截短形式的MD1形式的表达
。 　　对于NT质粒 ，为了过表达MD1的N末端
，我们从IV阶段/V阶段的Gametocyte cDNA放大了外显子1，引物为211/212（1,039 bp）。该片段被克隆到通过融合HD克隆消化后在AVRII和NAEI消化后将其克隆到PLN-MD1-PROM-HAX3-INTTERITE中 。如上所述 ，FL质粒对应于用于互补的
。 　　为了通过双跨界同源重组事件在MD1的C末端引入三重血凝素（HAX3）标签
，设计了两个供体序列，以靶向立即上游（同源性区域1; HR1）或下游密码子的下游（同源区域2; HR2; HR2; HR2; HR2）的区域。通过使用底漆114/115（630 bp）从基因组DNA放大HR1 ，而HR2用底漆116/117（554 bp）放大 。在用NAEI和ECORV（HR1）或AFLII和BAMHI（HR2）消化后
，通过融合HD克隆（Clontech）将这些片段依次插入质粒PLN-HAX3中
。引物115中包括三个盾牌同义突变，以防止重组后CAS9靶向。选择靶向基因3'端的SGRNA ，并将SGRNA序列（退火引物G31/G32）克隆到PDC2-CAS9-HDHFR-YFCU质粒中 。同时转染了两个提供供体重组序列的质粒
，另一种是提供供体重组序列，另一个质粒均已转染 ，以获得无痕迹的标签插入，以获取无选择标记的基因座。由此产生的寄生虫线称为MD1-3XHA
。 　　该质粒是通过MD1：HAX3质粒生成的
，通过用T2A：从具有147/148引物的模板质粒放大的T2A：GFP盒子，通过T2A：GFP盒子来代替3xHA标签。在MD1：HAX3质粒与NAEI和AFLII消化后 ，它与融合内的HD克隆组装在一起 。使用相同的引导质粒（G31/G32）将框架中的T2A：GFP盒与C末端的MD1集成
。由此产生的寄生虫线称为MD1-2A-GFP。 　　该质粒是通过用涡轮盒代替3xHA标签的MD1：HAX3质粒产生的 。通过使用引物316/317
，从模板质粒3xHA-Turboid-NLS_PCDNA3（Addgene;No
。107171）放大了后者。在消化MD1：HAX3质粒和Aflii和draiii后，它与融合内的HD克隆组装在一起 。使用相同的引导质粒（G31/G32）将涡轮盒与C末端的MD1集成
。由此产生的寄生虫线称为MD1-Turboid。 　　为了删除MD1的​​第一个内含子 ，我们设计了一个671 bp基因片段G-block（IDT）
，其中包括第一个外显子的最后313 bp，然后是第二个外显子（317 bp）的开始 ，不包括内含子 。G-Block在其5'和3'端20 bp的重叠序列中包括在用ecori和aatii消化之后
，通过Gibson组装插入PDC2-U6-CAS9-CAS9-CAS9-CAS9-HDHFR30质粒中
。此外，G-block还包括五个同义屏蔽突变 ，以防止CAS9靶向在基因座的修改后。将退火引物G94/G95产生的SGRNA序列克隆到带有G-Block的PDC2-CAS9-HDHFR-YFCU质粒中 。所得寄生虫线称为ΔInt1。 　　我们在MD1启动子中鉴定了一组四个SGRNA（散布在起始密码子之前的600 bp上）
。将退火引物G52/G35
，G54/G39，G55/G41和G56/G43产生的每个SGRNA序列都克隆到BTGZI位置上的J. Bryant31提供的序列优化PL7中。用PUF_DCAS9-3HA-GLM（30 µg; 30 µg; DSM1的1.5 µM DSM1连续选择）也将四个PL7质粒（每只15 µg；用2.5 nm的WR99210连续选择）连续选择 。制备了一个控制寄生虫线 ，该线仅携带PUF_DCAS9-3XHA-GLMS（MD1-DCAS9-CTRL）
。 　　补充表1中提供了用于基因分型，克隆和CRISPR -CAS9指南的所有引物的列表。 　　培养的V期配子细胞以600克旋转3分钟 。丢弃上清液后
，将沉淀重悬于20×颗粒体积中0.15％皂苷（Sigma）在冰上持续5分钟，并用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPB）洗涤一次 ，一次将PELLET重悬于1卷（50 µL）的100 µL（50 µL）中
，并将其重新悬浮在Trizol（50 µL）中，并播出了Trizol（50 µL）
。-80°C。根据Trizol制造商的说明将RNA隔离 。用无涡轮DNA的试剂盒（Invitrogen）对RNA进行DNase处理
。使用提供的随机六聚体并添加寡素（Invitrogen） ，用高能力cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）生成cDNA
，并在37°C下孵育1小时，然后在95°C下10分钟。QRT -PCR使用Power SYBR绿色主混合物（Applied Biosystems） ，在最终混合物中
，底漆为400 nm，并在以下循环程序中进行400 nm：在95°C下进行1分钟的单个孵育 ，持续1分钟
，然后进行44个循环（95°C 95°C，10 s ，60 s，60°C 60 s） 。对于LNCRNA QRT – PCR
，将循环程序修改为在95°C的单个孵育1分钟，然后进行44个循环（95°C持续10 s ，58°C
，持续10 s，68°C 30 s）
。使用ΔΔCT方法32计算折叠变化。通过使用管家基因UCE33归一化的PFMGET9测量性别比 。用内含子底漆进行表达测量 ，并用UCE33进行标准化。补充表1中提供了所有引物的列表
。 　　为了测量雌性配子细胞的比例
，将V期配子细胞涂抹在载玻片上，用冷100％甲醇固定 ，并用阻断溶液（1％胎牛血清（Thermo Fisher）在PBS中）封闭1小时。将寄生虫用0.1％Triton X（Sigma）透化10分钟
，并在PBS（Gibco）中用0.1 M甘氨酸淬灭10分钟 。将载玻片与在室温下阻断溶液中稀释的一抗孵育2小时；小鼠单克隆抗α-微管蛋白（Sigma）和兔多克隆抗PFG377（由P. alano提供）在1：500时使用
。将载玻片在PBS中洗涤3次，并用二级抗体（1：1,500 ，Thermo Fisher）在阻断溶液中孵育1小时。将载玻片安装在延长的金抗铁试剂（Thermo Fisher）中
，并在Zeiss Axiolmager Z2上观察到×40的油浸入透镜 。 　　为了评估MD1-3XHA融合蛋白的定位，用4％多聚甲醛固定了II期至V GAGAMETOCTES ，并被允许在4°C下固定在聚赖斯碱涂层玻片（Thermo Scientific）过夜
。用1×Tris缓冲盐水（TBS）将寄生虫洗涤四次，在PBS中用0.2％Triton X透化5分钟
，并用10％的山羊血清阻塞，在TBS中3％BSA 1小时。然后将载玻片与在4°C下在TBS中稀释的初级抗体在1％BSA中孵育过夜；使用1：2,000的多克隆兔抗ERD2（BEI ，MRA-72）
，单克隆大鼠抗HA（Roche，3f10）使用在1：500时 。二级抗体Alexa-Fluor 488/568抗鼠或抗兔（Thermo Fisher）在含有1％BSA的TBS中使用1：1,500稀释 ，并在室温下孵育1小时
。将载玻片与DAPI（Thermo Fisher）一起安装在荧光素-G中
，并在带有Zeiss Zen Zen显微镜软件（v.2.3 sp1）的Zeiss LSM 880 Jieryscan共聚焦显微镜上成像×63油浸入式晶状体。图像是在fiji34中处理的，通过使用堆栈共定位分析仪在Z-stacks上实现了GDSC插件 ，以在不同通道之间获得Pearson的R系数 。 　　应激后三天
，将120 ml WT，ΔInt1或Δ270–699寄生虫的培养物补充了20 U ML -1肝素
。压力后第9天收获培养物。将颗粒重悬于10倍的PBS颗粒体积的10倍 ，该体积的PBS含有0.15％的皂苷
，在冰上孵育5分钟，用冷PBS洗涤3次 ，并在4°C下在3,200g的4°C下离心5分钟 。然后，通过在150 µL的裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8
，150 mm NaCl，1％NP40 ，4 mm EDTA
，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒（Sigma-Aldrich））中重新悬浮，将寄生虫颗粒裂解 ，并在4°C旋转。为了提高均匀性和流动性
，裂解物在27 g注射器上通过10次通过10次，超声处理3次 ，5 s通过在冰上冷却25 s（Branson Sonifier）
，然后在15,000g下在4°C下离心15分钟
。收集上清液，并加入50 µL的Laemmli 4×（Bio-Rad）和10 µL的β-甲醇乙醇。根据制造商的协议 ，在S型微型自旋柱（Protifi）上进行蛋白质消化 。简而言之
，将蛋白质提取物（300 µg）重悬于SDS缓冲液（5％）中，在95°C下用20 mm的二硫代甲醇（DTT）降低10分钟 ，并用40 mm的碘氨基胺在黑暗中用40 mm的iodoactamide烷基化
。将磷酸酸性的样品（最终12％）稀释在结合缓冲液（100 mM碳酸氢铵（碳酸氢铵）（TEABC）中，在90％甲醇中）
，并将蛋白质捕获在色谱柱上。通过在47°C下添加1 µg胰蛋白酶（黄金，Promega）2小时 ，进行酶促消化 。用50 mm的茶具和甲酸洗脱肽
。用反向相位的肽样品在八个部分中的乙腈步骤（高pH反相肽分馏试剂盒
，Thermo Fisher Scientific）中分离。通过使用Q-激活HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific）与最终3,000 RSLC（Thermo Fisher Scientific）相连的Q-激活HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific），通过纳米流量HPLC-Nano电喷雾电离分析样品 。
。样品的脱盐和预浓缩是在pepmap proadumn（0.3 mm×10 mm; Thermo Fisher Scientific）上在线进行的。用缓冲液A（0.1％甲酸）引入肽（PEPMAP 100 C18; 0.075 mm×500 mm; Thermo Fisher Scientific） ，并以300 nl min -1的流量为300 nl min -1
，用2-40％的缓冲液B（0.1％甲酸80％CAN）洗脱 。将洗脱的肽电喷雾到Q活性HF质谱仪中
。使用Xcalibur软件（V.4.2 Thermo Fisher Scientific）获取光谱。MS/MS分析以数据依赖性模式进行 。在Orbitrap质量分析仪中获得了全面扫描（375–1,500 m/z），以200 m/z的分辨率为60,000。对于全面扫描 ，在60 ms的最大注射时间内积累了3×106离子
，并在Orbitrap分析仪中检测到
。12个具有电荷状态≥2的最强烈的离子被顺序分离为1×105的目标值，最大注射时间为100 ms ，并通过碰撞电池中较高的能量碰撞解离（归一化能量为28％）
，并在OrbitRap分析仪中以30,000分辨率检测到。使用最大环境（v.2.0.3.0）35和andromeda处理数据库搜索，并使用无标签量化（LFQ）处理原始光谱 ，并启用了IBAQ算法之间的匹配 。将MS/MS光谱与恶性疟原虫（3D7，蛋白质组ID UP000001450; 2022_01）
，链霉亲和素蛋白和Δ270-699MD1序列和250个经常观察到的污染物以及所有入口序列的250序列匹配的MS/MS光谱
。应用默认搜索参数。将氧化（Met）和乙酰化（N-期限）用作可变修饰，氨基甲基化（CYS）用作固定修饰 。对于肽和蛋白质 ，FDR设置为1％
。通过使用内部生物信息学工具自动选择每个组中的代表性ID（领导V.3.4）。第一的
， 在“匹配组 ”中隔离了具有众多鉴定肽的蛋白质（来自“蛋白质IDS
”色谱柱的蛋白质具有最大“肽计数”的蛋白质） 。对于过滤后有多个蛋白质ID的匹配组，Uniprotkb中最好的注释蛋白质定义为“铅 ”蛋白（Uniprotkb-goa ，于20220317制造）
。MS蛋白质组学数据已通过数据集标识符PXD035547和10.6019/pxd035547通过Pride37合作库来存放到ProteOmeXchange联盟中。所有处理的数据都包含在补充表2中 。 　　压力后第6天到第10天之间恢复了培养物
。将培养悬浮液以600克离心4分钟。将颗粒重悬于10倍的含量的PBS颗粒体积的10倍
，该PBS含有0.15％的皂苷，在冰上孵育5分钟 ，然后用冷PBS洗涤3次
，并在4°C下以3,200G离心5分钟 。将寄生虫重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris pH 8，150 mm NaCl ，1％NP40
，4 mM EDTA，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）（100 µL液压缓冲液）（100 µl lysis fuffer）在4°c上孵化4 h h HOR型4 h h HOT 4°c。通过以15,000克离心在4°C下以15,000克离心15分钟来阐明裂解物
。通过用1×Nupage LDS样品缓冲液（Fisher）煮沸5分钟 ，并补充有100 mM DTT，并在10％SDS -PAGE凝胶上分离
，将蛋白质变性5分钟。将凝胶转移到硝酸纤维素膜（Amersham）上，并用Ponceau S染色（1％乙酸中的0.1％（w/v）） 。用PBS – 0.1％Tween 20（PBS-T）在室温下用5％（w/v）的牛奶（Bio-Rad）封闭印迹 ，然后在PBS-T中洗涤3次
。然后将印迹与小鼠抗HA抗体（Fisher）在PBS-T中的5％牛奶中在4°C的5％牛奶中孵育
，用TBS-T进行3次洗涤，每次用TBS-T洗涤5分钟5分钟 ，然后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG抗体IgG抗体（Bio-Techne）在1.5％BSA中均为1 HATED ATCON ATCON ATCON ATCORATY 1 HATED ATDEAR。将印迹用PBS-T洗涤3次
，每人5分钟，然后使用Immobilon Forte WB HRP底物（Millipore）进行开发 ，并在Imager 680（Amersham）或Chemidoc MP（Bio-Rad）上成像 。原始印迹图像如图2所示
。 　　制备了三个重复的WT和三个重复的MD1-涡轮增压。每个复制都由两个40毫升培养物相隔两天 。压力两天后
，将细胞在无生物素的RPMI（细胞培养技术）中洗涤，并用无血清 ，无生物素的RPMI替换了培养基
，并补充了1％clesumax，10 mg ML-1低黄嘌呤和20 U ML-1肝素
。每天更改媒介直到恢复。分别在第7天和第9天应压缩培养物 。收获之前 ，用100 µM生物素（Thermo Scientific）的2小时脉冲处理培养物
。如上所述，用皂苷和裂解处理细胞
，并在冷PBS中洗涤五次，以消除过量的生物素。然后将80μl链霉亲和素涂层的磁珠（Fisher）洗涤3次 ，并用蛋白酶抑制剂鸡尾酒补充
，然后用澄清的裂解物在旋转轮子在4°C下孵育过夜 。随后用裂解缓冲液将珠洗涤两次，一次用1 ml 1 m kCl洗涤 ，一次用1 ml的0.1 m Na2co3洗涤
，一次在10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中用1 ml 2 m的尿素（pH 8.0），用1 ml Lysis Buffer38 ，在10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中用1 ml 2 m尿素。使用低蛋白结合管
，并在珠洗涤过程中将样品转移到两次新试管中
。通过将5分钟的珠子煮沸在80μl的4×Laemmli（Bio-Rad）中煮沸的珠子，将生物素化蛋白洗脱 ，并补充了100 mM DTT。用磁铁和在20,000g和4°C离心5分钟
，将珠子除去5分钟 。如上所述，然后在SDS -PAGE凝胶上运行20 µL裂解物 ，20 µL流经和5 µL洗脱样品
。将印迹在酪蛋白缓冲液（Bio-RAD）中阻塞，并与HRP偶联的链霉亲和素（Cytiva
，1：5,000）在酪蛋白缓冲液中孵育45分钟至1小时，然后在室温下进行3次洗涤3次 ，然后用PBS-T洗涤5分钟
，每人每人5分钟，然后如上所述。原始印迹图像在补充图2中显示了MS制备的图2 。 使用短（2 cm）迁移通过SDS -PAGE凝胶分离45 µL洗脱蛋白 ，以避免生物素污染
。为每个样品切除单块凝胶
，并使用胰蛋白酶（Gold，Promega）39凝胶中蛋白质。MS处理和分析如上所述 。LFQ用于鉴定条件之间差异富集的蛋白质
。仅分析了所有MD1-涡轮重复的命中。将两个样本t检验应用于WT和MD1-涡轮增压的Log2（LFQ）值 。在仅在一个重复中检测到WT的情况下 ，我们通过将WT值用作对MD1-Turboid中检测到的三份值的平均值应用了一个样本t检验
。通过使用FDR方法调整P值以进行多次测试。为了计算MD1-TurboID/WT比率
，我们将数据集中检测到的最低LFQ值（16）归为WT条件下的缺失值，然后使用校正后的LFQ值计算了Log2（MD1-Turboid/wt） 。All processed data and calculations are included in Supplementary Table 2. The list of highlighted hits in the volcano plots is described in Supplementary Table 2. The MS proteomics data have been deposited to the ProteomeXchange Consortium v​​ia the PRIDE partner repository37 with the dataset identifier PXD035553 and 10.6019/PXD035553. 　　两种方法用于单细胞转录组学 ，10倍基因组液滴测序用于表型突变体
，因为它允许每个样品产生数千个细胞，从而极好地覆盖了性别确定和分化过程。SmartSeq2是表征MD1-2A-GFP系列的首选 ，因为通过使用此方法，每个转录组可以与细胞排序中获得的信息相关联
，例如由GFP强度信号给出的蛋白质表达水平
。具有基于液滴的单细胞RNA-Seq的细胞内荧光蛋白不可能。 　　WT，KO和δ270-699菌株的四种不同的配子细胞培养物以2天的间隔接种 ，初次入侵后肝素（20 U ML-1）添加了肝素（20 U ML-1）
，以去除所有剩余的无性恋形式 。在压力后，在第3 、5
、7和9天收获培养物
。对GIEMSA染色的薄血涂片进行了评估 ，并在血细胞计数仪上评估了细胞密度。每个基因型的四个时间点的细胞以1：1：1：1的比率合并 。将这些池再次以相同的方法进行计数
，并以72,000 rbc µl -1（NF54），74,000 rbc µl -1（Δ270-699）和85,000 rbc µl -1（KO）的浓度播种
。如所述的10倍铬平台处理每个池 ，目标恢复为每次运行8,000个寄生虫细胞
，并使用V3化学。将测序在Novaseq 6,000 S1流动池的半道道上多路复用，并具有成对的末端（PE）测序（26和98 bp） ，每次运行约15亿读 。通过使用Cell Ranger v.6.0.1
，将数据反复列出并映射到恶性疟原虫V3基因组序列（GenEDB，2021年6月）
。 　　单细胞转录组学以前报道了10,20 ，并进行了轻微的修改。简而言之，在4°C下以500克旋转3分钟
，在DPB（Thermo Fisher）中洗涤一次，并用2.5 µm的Mitotracker深红色FM（Thermo Fisher）在DPB中染色15分钟 。通过使用BD FACSDIVA软件（v.9.0.1） ，在用100 µM喷嘴的Facsaria II细胞分选仪（BD Biosciences）上进行细胞分选
。通过在单细胞事件以及APC和GFP频道上进行门控进行分类配子细胞。补充图1显示了门控策略 。使用染色的未感染的RBC控制来建立门控策略。将单个细胞在含有4 µL裂解缓冲液的96孔板中分类（无RNase无RNase Triton X（Fisher）在无核酸酶的水（Ambion）中
，用紫外线光5分钟用地层链接链链接器2,400在200,000 µJ cm-2 cm-2，2.5 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm dnts中（2,400（5'-aagcagtggtaTcaAcgCagagtActttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3'）和2U超级素（Life Technologies））和2U
。分类的板以1,000克旋转10 s ，并立即将其放在干冰上。将板在72°C加热3分钟 。含1 µm LNA-寡核苷酸（5'-AgcagtggtggtaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaCgCagagtacatRgrg+g-3'; Qiagen）
，6 µm mgcl2，1 m betaine（vwr） ，1×反向转录缓冲
，SMART 50 µm dttt，0.5 u us smplern和smarts smplern ans ，一个0.5 U u us smplern和0.5 u u uns smarts and 0.5 u u usss smplern和0.5 u u usss smplern和0.5 u
，（Takara）被添加到盘子中
。反应的总体积为10 µl。使用以下循环条件：在42°C下单个孵育周期90分钟；然后是10个循环（42°C 2分钟，50°C 2分钟）；在70°C的最终孵育15分钟之前 。将进一步的PCR混合物添加到板上 ，其中包含1×kapa Hotstart Hifi readymix和2.5 µm的ISO Smart Primer40，并通过使用以下程序进行孵育：在98°C下进行3分钟的单个孵育
，持续3分钟，然后进行25个循环（98°C ，在20 s
，67°C供15 s，67°C供15分钟 ，72 s
，72 s，72 s） ，72°C）
。 并在72°C下孵育5分钟。用1×琼脂膜珠（Beckman Coulter）纯化反应 。用10 µL无核酸酶水（Ambion）洗脱扩增的cDNA
。用高敏感性DNA芯片（安捷伦）用Agilent 2100 Bioanalyser评估了cDNA样品子集的质量。根据制造商的建议
，使用Nextera XT 96试剂盒（Illumina）来制备测序库，但使用季度反应 。使用了A和B的双索引（Illumina）进行192个不同的指数组合
。将图书馆汇总并用Agencourt Ampure珠（Beckman Coulter）以4：5的比例进行清理。用高敏感性DNA芯片（安捷伦）在Agilent 2100生物分析仪上进行了高敏性DNA芯片（Agilent）评估库的质量 。MD1-2A-GFP转录组在两个样品的两个池中多路复用 ，每个样品在HISEQ 2,500的车道上进行了排序
，并在50个hiseq 2,500中进行了测序，FastQ文件是在基本通话后获得的 ，并用Illumina的软件进行了反复。使用Trim_Galore -Q 20 -a ctgtctcttcttatatataCatctct -Paired -stringency 3 -长度50 -e 0.1，使用Trim Gallore（V.0.6.5）修剪Nextera适配器序列
。HISAT2（v.2.0.0）（参考文献41）索引是为恶性疟原虫V3基因组序列（GenEDB
，2019年11月）使用默认参数生成的。通过使用HISAT2-MAX-INTRONLEN 5000 P 12将修剪的成对读数映射到恶性疟原虫基因组序列上 。通过使用SamTools-1.2视图–B将SAM文件转换为BAM，并与Samtools-1.2排序进行分类
。通过使用HTSEQ -COUNT -F BAM -R POS -S -SNO –T CDS使用htseq（v.0.12.4）42获得读数计数 ，该读数是通过使用其他WhereWhere20所述的自定义GTF获得的。所有单细胞运行中的原始读取计数均可在线43 。为了分析剪接连接
，通过使用-m -Max_length 2000 -min_cov 3，将SMARTSEQ2数据集的分类BAM与PortCullis（v.1.2.2）44处理
。将所得的床文件分类并与Bedtools合并（v.2.29.1）45。 　　最初使用seurat（v.4.0.4）46过滤10倍数据 。从分析中除去每个数据集中少于两个细胞中存在的基因和基因少于1,000个基因的细胞
。通过使用标准化方法将数据归一化 ，并用含量化的方法识别可变特征
，并用FindVariableFeatures鉴定出数据，并用scaledata缩放数据。KO和Δ270–699数据集均与WT合并以进行组合分析 。识别双线并用SCDBLFINDER过滤（V.1.6.0）47
。过滤和拆卸双压力集后 ，我们分别为WT
，KO和Δ270–699数据集恢复了2,076、2,535和2,951个高质量的细胞。对于SMARTSEQ2，计数数据被读取为单细胞实验（V.1.8.0）48 ，并在Scater中进行了归一化（v.1.20.1）4,9
，并且从分析中删除了少于1,000个基因或25,000个读取的细胞 。在分析中保留了至少五个读取在两个以上细胞中鉴定的基因。过滤导致322个高质量的转录组
。 　　主成分分析是在Scater（v.1.20.1）49中进行的，并且通过使用SCMAP（v.1.8.0）50正式确定细胞的性认同 ，将数据集映射到包含来自疟疾细胞疟疾细胞的现有恶性疟原虫数据集中。我们构建了参考数据的单元格索引，并使用SCMAPCELL函数将每个查询单元（从数据集）分配到具有最高余弦相似性的索引单元格 。然后
，我们可以将该索引单元的元数据分配给查询单元
。我们使用了分配余弦相似性阈值0.75。这种方法在我们的WT-KO，WT-Δ270-699和MD1-2A-GFP数据集中定向根（祖先）和两个分支（男性和女性） 。为了在轨迹中订购单元 ，我们使用弹弓（V.1.4.0）51实现了谱系和假频率分析
。首先将细胞由Kmeans聚集
，然后识别具有Getlineages的谱系结构，然后进行带有GetCurves的同时主曲线分析 ，该分析符合分支曲线与已识别的谱系拟合并为每个谱系提供假频率估计。在从祖细胞到男性或分支的女性尖端的所有情况下
，将细胞分配到两个发育道路 。祖细胞被定义为两个谱系中存在的细胞，雄性细胞是女性发育途径中不存在的一个细胞 ，而雄性发育路径中没有雌性细胞
。沿每个谱系的基因型组成的表示形式是用数据子集生成的
，其中50个单元格以每个kmeans群集随机选择，以校正每个数据集中群集的不均匀表示。使用桅杆软件包（V.1.3.4）52进行差异表达分析 ，其中用ZLM实现了每个基因的栏模 。对数倍数变化的基因高于1.25
，而FDR较低1％的基因被认为是差异表达的
。 　　通过离心（在4°C下500g持续3分钟）收集109个NF54配子细胞（II级至V），然后在冰上在DPBS中用0.15％皂苷（Sigma）裂解2分钟 ，然后用DPB洗涤一次。然后根据制造商的方案将RNA用Trizol试剂（Thermo Fisher）提取 。使用Agilent 2100生物分析仪的RNA 6,000纳米试剂盒（Agilent）检查RNA质量。用Dynabead mRNA纯化试剂盒（Thermo Fisher）处理总RNA（75μg）
。使用牛津纳米孔技术的直接RNA测序试剂盒处理500 ng的聚-A RNA。In brief, the library is generated by ligation of a 3′ adaptor on the RNA molecules, followed by reverse transcription with Superscript III (Thermo Fisher), purification of the DNA–RNA hybrids with Agencourt RNA XP beads (Beckman Coulter), ligation of the 1D adaptor, purification with Agencourt RNA XP beads (Beckman Coulter) and quantification of通过使用DNA HS试剂盒（QUBIT）的DNA – RNA杂种 。将样品用对照RNA（5％）加入，并加载在奴才流中（牛津纳米孔）上
。按照Minknow软件（V.19.10.1）的建议进行测序。在Guppy（v.3.4.3）中进行了基本调用
，并使用PycoQC（V.2.5.0.10）进行质量控制 。在质量控制之后，平均PHRED得分为10.63 ，读取中位数为698 bp的639,440读
。将数据与MiniMAP2（v.2.17-R941）53对齐到对照RNA序列和SAMTools（v.1.9）54 STAT用于计算运行错误率
，该错误率为6.72％。通过使用miniMAP2（v.2.17 -r941）53，将读取与恶性疟原虫基因组V3（GenEDB ，2019年11月）对齐 。79.8％的读取映射到参考基因组
。使用GenoMecoverageBed命令
，使用BedTools（v.2.29.1）45生成滞留的床文件。使用R软件包寿司（V.1.24.1）进行了覆盖范围分析和读取可视化 。55
。用CPAT19测试LNCRNA的编码势。 　　对于所有实验，图传说中都提供了生物重复的数量 。使用RSTUDIO（V.1.4.1717）在R环境（V.4.1.0）中进行统计分析。首先通过实现具有默认参数的f检验来比较两个样本的方差 ，首先测试IFA和QRT – PCR性别比率测量值
。然后
，使用具有默认参数（双面）的学生t检验并根据f-Test的结果来比较样品。通过Fisher的精确测试计数数据，对表达的相互排他性进行了测试 。图中的显着性代码：NS ，不重要；*
，p <0.05;**，p <0.01;*** ，p <0.001
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。