HELQ是由RPA和RAD51调制的双功能DSB修复酶

　　自定义的螺旋螺旋形是从Geneart购买的，并在PCR期间用作模板 ，以使质粒（PFASTBAC1）兼容
，以使其在昆虫细胞中表达bacmid制备 。为了准备MBP-HELQ-FLAG构建体，使用Primers Helq_f和Helq_flag_r通过PCR扩增Helq
。用BAMHI和XMAI消化放大的插入物 ，并插入含有MBP的PfastBac1载体（麦芽糖结合蛋白标签；先前使用ECORV和HINDIII限制位点插入）。所得的构建体是PFB-MBP-HELQ-FLAG 。为了制备解旋酶超过的螺旋（K365M），使用Q5位置定向的诱变试剂盒根据制造商的指示
，使用引物HELQ_K365M_F和HELQ_K365M_R诱变PFB-MBP-HELQ-FLAG。PET11C-RAD51和RPA – EGFP（PMM801）和RPA-MRFP1（PMM802）的构建体分别是L. Krejci和M. Modesti的礼物
。 　　为了表达昆虫细胞中的蛋白质，根据制造商的指示（BAC-to-BAC系统 ，生命技术）制备了Bacmid
，原发性和继发性杆菌病毒。为了表达重组MBP-HELQ-FLAG，将Spodoptera frugiperda（SF9）昆虫细胞以每毫升500,000个细胞播种 ，并且在24小时后
，细胞被MBP-HELQ-HELQ-HELQ-HELQ-HELQ-FLAG杆状病毒感染 。在连续搅拌下将感染的细胞在27°C下孵育56小时
。通过以500g离心10分钟收集细胞，并用1×PBS（137 mm NaCl ，2.7 mM KCl
，10 mm Na2HPO4，1.8 mm KH2PO4）洗涤一次。收集的颗粒在液氮中被捕集 ，并在-80°C下储存直至进一步使用 。随后的所有步骤均在冰上或4°C上执行
。将细胞沉淀物恢复在3量的裂解缓冲液中
，其中含有50 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM乙二胺乙酸乙酸（EDTA） ，蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche），30 µg Ml-1 lipeptin（Merck）
，1 mm苯基苯基苯基菌（1 mm）libylillyl-fllioride（pps）（DTT），0.1％NP-40替代品（NP-40） ，并连续搅拌孵育15分钟。接下来
，将50％的甘油和5 m NaCl顺序添加到最终浓度16.7％和310 mM中，并在连续搅拌下进一步孵育30分钟 。将悬浮液以〜48,000克离心30分钟 ，以获得可溶提取物
。将淀粉酶树脂（NEB）用淀粉液洗涤缓冲液I（50 mM Tris-HCl pH 7.5
，1 mm 2-甲醇（β-ME），1 M NaCl ，1 mM NaCl
，1 mM PMSF，10％甘油 ，10％甘油和0.1％NP-40和0.1％NP-40）
，并添加到50 mL小管中。随后将这些试管连续旋转孵育1小时 。孵育后，通过在2,000克以2,000克离心2分钟将树脂洗涤四次 ，并用淀粉液洗涤缓冲液在柱上两次用链淀粉洗涤液进行两次，用淀粉液洗涤缓冲液II多列在柱上再洗涤两次（与洗涤缓冲液I相同
，但使用0.5 mmβ-me和0.8 m nacl）
。使用双淀粉洗脱缓冲液（与补充10 mM麦芽糖的淀粉液洗涤缓冲液II相同）从树脂中洗脱蛋白质，并使用Bradford分析估算总蛋白质。为了删除MBP标签 ，将1/8（w/w）的预缩蛋白酶的1/8（w/w）添加到总蛋白质中
，将其添加到链淀粉洗脱中，并在不旋转的情况下孵育2小时 ，但要定期轻轻搅拌 。将国旗树脂（抗flag M2树脂
，Sigma-Aldrich）添加到添加到含有预启发蛋白酶和连续旋转的预启动型固定型中，并添加了添加到含有淀粉蛋白的淀粉液中 ，将其添加到添加到含量的淀粉液中。将国旗树脂直接收集在柱上
，并用旗缓冲液洗涤六次
。将蛋白质从具有国旗洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5mmβ-Me ，150 mM NaCl
，1 mm PMSF，10％甘油 ，150 ng µl-1 3×3×Flag肽（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich））中，液化和液体NITONDROZEN的蛋白质和Freogent。使用相同的纯化程序纯化螺旋（K365M） 。 　　如前所述
，重组人Rad51纯化了一些修改30
。将PET11C-RAD51表达载体转化为大肠杆菌BLR（DE3）PLYSS细胞，然后将含有氨苄西林（100 mg l-1）和氯霉素（33 mg L-1）的随后培养物生长至600 Nm的光学密度（OD）0.7的光学密度（OD）。用1 mM异丙基β-1-甲状腺乳糖苷糖苷（IPTG）在37°C下诱导RAD51表达3-4小时 。随后的所有步骤均在冰上或4°C下进行
。通过以5,000克离心收集细胞。Cell pellets were resuspended in cell breakage buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% sucrose, 0.5 mM EDTA, 1 M KCl, 1 tablet per 50 ml of protease inhibitor cocktail tablets (Roche), 1 mM PMSF, 1 mM DTT and 0.01% NP-40), sonicated and centrifuged at 100,000g for 1 h.为了沉淀Rad51 ，将0.242 g ML -1硫酸铵与澄清的上清液混合
，并在10,000g下离心20分钟 。将沉淀物重悬于缓冲液K（20 mm K2HPO4 pH 7.5、10％甘油，0.5 mm EDTA ，1 mm DTT
，0.01％NP-40）中，并加载到Q Sepharose快速流柱（Cytiva）上 ，并与K Buffer-low（k Buffer-low）预先校准（cytiva）
，并与k Buffer-low（k Buffer-low）（k Buffer-low）（k Buffer-kcl Buffer Replected）
。用k缓冲液-LOW广泛洗涤该色谱柱，然后使用k缓冲液-HIGH（补充0.6 m kCl的K缓冲液）用KCL梯度洗脱蛋白质。将含有RAD51的洗脱馏分汇总 ，并用6体积的稀释缓冲液（25 mM Tris HCl pH 7.5
，0.5 mm EDTA，1 mm DTT ，0.01％NP-40）稀释 。将稀释的样品加载到HITRAP肝素HP亲和力柱（Cytiva）上，该柱将其用无甘油的缓冲液进行预取平衡（25 mm Tris Hcl PH 7.5
，0.5 mm EDTA，1 mm DTT ，1 mm DTT
，1 mm DTT，0.01％NP-40 ，150 mm kCl）
，并用含有Buffer h buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buffer buldcerol含有10％％glycerol
。将蛋白质在缓冲液中用KCl梯度（0.1 m至1 m kCl）洗脱，并将含有RAD51的馏分合并 ，并在没有甘油的缓冲液中透析。将透析样品加载到单声道Q 5/50 GL柱上 （Cytiva）
，用缓冲液Q（25 mM Tris HCl pH 7.5，0.5 mm EDTA ，1 mM DTT
，0.01％NP-40，100 mm KCl ，10％甘油）平衡，并用含有50 mm KCl但缺乏甘油的缓冲液进一步洗涤柱 。从缺少甘油的缓冲液Q中
，从单声道Q柱（0.05 m至1 m）的单声道Q柱中洗脱了Rad51。合并了含有RAD51的洗脱级分，并与Vivaspin离心浓缩剂（30 kDa分子量截止（MWCO））进一步浓缩
。将甘油添加到浓缩样品中 ，最终浓度为10％。最后
，将样品等分，冷冻在液氮中 ，并在-80°C下储存 。使用相同的程序纯化RAD51（C319）突变体
。如先前所述
，纯化了RPA – MRFP1和RPA -EGFP。重组RECA（M0249）和ET SSB（M2401）购自英格兰NEB 。 　　为了纯化GST和GST-BRC4，将BRC4构建体克隆到PGEX6P-1矢量中 ，该向量包含使用BAMHI和ECORI限制位点的GST标签
。将PGEX6P-1和PGEX6P-1 – BRC4构建体转化为BL21 DE3细胞
，并将其铺板到含有氨苄青霉素的琼脂板上（100 µg mL-1）。将一个菌落分离，并在一夜之间接种成6毫升的practure 。第二天 ，将4.5 mL的旧培养基添加到含有氨苄青霉素（100 µg mL -1）的450 mL Lb培养基中
，并定期监测600nm时的OD
。用0.6 OD的1 mM IPTG诱导蛋白质，并将培养物孵育4小时。收集细胞颗粒 ，用冷PBS洗涤，并在-80°C下储存 。为了纯化
，将细胞颗粒通过PBS中的超声处理裂解，并在4°C下以75,600克离心30分钟
。接下来 ，收集上清液并在4°C下与1.2 mL谷胱甘肽树脂一起孵育1小时。将树脂用PBS洗涤3次
，并用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mm谷胱甘肽）洗脱蛋白质 。将洗脱的蛋白质等分 ，在液氮中捕集
，并储存在-80°C下。 　　如前所述，RAD51（C319）变体被表达并纯化 ，如WT Rad51（参考文献30,32）
。纯化后
，根据先前所述的方案31，将蛋白质用Alexa Fluor 488 C5 MaleImide（Thermo Fisher Scientific ，A10254）标记为荧光标记。使用Zeba柱凝胶过滤系统（0.5 mL树脂
，50 kDa MWCO）将标记的蛋白质从游离染料纯化 。通过Coomassie染色估算蛋白质浓度，并通过分光光度法测量染料浓度
。使用标记蛋白上的SDS -PAGE评估了最小游离染料浓度的存在。蛋白质与染料浓度比始终为0.9-1.0 。测试了标记为RAD51的D-Loop形成 ，并给出与未标记的WT Rad51蛋白相当的产率，与先前的报道一致
。32。如前所述31表示RPA – EGFP和RPA -MRFP1 。测试了标记RPA的DNA结合
。所有RPA融合蛋白在纳摩尔KD范围内均显示出相似的ssDNA亲和力。 　　在体外分析中使用的所有DNA寡核苷酸均商业合成并从默克生命科学那里购买 。为了制备本研究中使用的各种底物
，在需要时，通过在95°C的95°C混合和加热3分钟 ，将DNA寡核苷酸的组合一起退火
，然后将样品逐夜逐夜冷却
。所使用的寡素的名称和序列如下：寡核1（5'fitc-agctaccatgcctgc acgaattaagcaattcgta atc​​atggtcatagct），寡核酸酯2（5'-agctatgaccatgaccatgatgctgattgcttaattgcttaattgcttaattgcgtgcgtgcgcaggcaggcaggcaggcaggcaggcatggcctgctgcgtgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcatgcatgcatagtcatgcatgcatgcatgcatgcatgcatagt）oligo 5 (AGCTATGACCATG ATTACGAATTGCTT), oligo 6 (AGCTATGACCATGATTACGAATTGCTTGGAATCCTGACGAACTGTAG), oligo 23 (5′-FITC-GACGCTGCCGAATTCTACCAG TGCCTTGCTAGGACATCTTTGCC CACCTGCAGGTTCACCC), oligo 22（gggtgaAcctgcaggtggg cg gctgctcatcgtaggttagtggtggtggaattcggcggcgtc） ，寡核酸盐（taagaagcaagatgttctataaaaa gatgtcctcctaggcac）
，Oligo 20（tatagaaCattgctta）（5'-FAM-AGCTACCATGCACG ATATAAGCAATTCGTAA TCATGGTCAGCT）和寡头（Aattcgtgcgcagcatggtggtagct-rox-3'）combinations of oligos were annealed together to prepare 3′ overhang (oligo 1 + oligo 4), 5′ overhang (oligo 1 + oligo 5), dsDNA (oligo 1 + oligo 2), Y structure (oligo 1 + oligo 6), lagging strand fork (oligo 1 + oligo 4 + oligo 6), D-loop (oligo 23 + oligo22，寡素21+寡素（寡核酸）和3'的悬垂性（寡核酸杆菌）用作SSDNA底物。CAACAATGAGTGGCAGATAT AGCCTGGTGGTTC), dT79 (5′-Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) andB-dT43 (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′-Bio), where Bio indicates the position of biotin in the oligo sequence. 　　The unwinding assays were performed in 15 µl helicase buffer containing 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.1 mg ml−1 bovine serum albumin (BSA, New England Biolabs), 1 mM PEP (phosphoenolpyruvate, Sigma-Aldrich), 10U ML-1丙酮酸激酶（Sigma-Aldrich）和5'-End-FITC标记的25 nm DNA底物（分子） 。除了组装反应和蛋白质添加以外的所有步骤均在黑暗中进行。将反应组装在冰上 ，并加入重组蛋白
，混合并在37°C下孵育30分钟
。用5 µL 2％停止溶液（0.2％SDS，30％甘油 ，150 mM EDTA
，Bromophenol Blue）和1 µL蛋白酶K（Roche，18.4 mg ML -1）停止反应 ，并在37°C下孵育10分钟。为了防止重新进行重新进行，补充了2％的停止溶液
，并具有与FITC标记的寡核酸相同序列的未标记的寡核的十倍 。使用Mini-Protean Tetra Tetra细胞电泳系统（Bio-Rad）在100 V时，用10％天然聚丙烯酰胺凝胶（19：1丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺 ，Bio-Rad）解决了产物
。将凝胶直接在Chemidoc MP成像系统中成像。 　　这些测定是在60 µL的解旋酶缓冲液中进行的
，该缓冲液用20 nm DNA底物（分子）进行 。DNA底物中的Oligo F（49-mer）在5'末端用6-氟cecein amidite（6-fam）标记，而在3'末端将Oligo R（22-MER）标记为3'末端
。将反应组装在96-Microwell板上的冰上 ，并将重组蛋白直接添加到各自的井中。在37°C下
，将微板板转移到微板读取器（Clariostar，BMG LabTech）中 ，并在每30秒钟内连续监测6个FAM强度
，持续60分钟 。使用GraphPad Prism将最终值绘制为图形
。 　　在包含25 mM Tris-HCl PH 8.0 、2 mM ATP，2 mM MGCL2
、1 mM DTT ，50 mM NaCl
，0.1 mg ML-1 BSA（新England Biolabs）和5'- End-End-fitc-labelled 25 nm dna subsece（15 µL）中进行EMSA反应（15 µL），该缓冲液含有25 mM Tris-HCl PH 8.0、2 mM ATP ，2 mM MGCL2 、1 mM DTT，50 mM NaCl
，0.1 mg Ml-1 BSA（新England Biolabs）和5'- End-End-Fitc-fitc-fitc-fitc-labelled 25 nm dna subs）除了组装反应和蛋白质添加以外，所有步骤均在黑暗中进行。将反应组装在冰上 ，并将重组蛋白添加到反应中
，混合并在黑暗中37°C孵育10分钟 。补充了5 µL的EMSA载荷缓冲液（50％甘油，溴酚蓝） ，并使用6％的天然Tbe聚丙烯酰胺凝胶（19：1丙烯酰胺 - 二异丙酰胺
，Bio-rad）使用Mini-Protean Tetra Tetra Cell Electrophoresis System（Bio-rad）（Bio-rad）在80 v con上进行45分钟
。最后，使用Chemidoc MP成像系统对凝胶进行成像。补充信息中提供了凝胶的扫描 。 　　如EMSA所述进行剥离测定法 ，除了在室温下解析产品
，并使用了更长的6％天然凝胶。 　　DNA退火测定在15 µL退火缓冲液中进行，其中含有25 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM ATP ，2 mM MGCL2
、1 mM DTT
，50 mM NaCl和0.1 mg ML-NACL和0.1 mg ML-1 BSA（新英格兰Biolabs）
。除了组装反应和蛋白质添加以外，所有步骤均在黑暗中进行。对于DNA底物 ，将10 nm（分子）互补的寡寡寡做（5'-FITC-OLIGO 1和OLIGO 2）分别在7.5 µL退火缓冲液中孵育，并如所示
，在冰上或没有RPA冰上持续2分钟 。将重组蛋白在冰上加入FITC-Oligo 1反应（7.5 µL），然后立即添加寡核酸2反应（7.5 µL）
。将反应在37°C下孵育10分钟。单个寡核和退火dsDNA产物的最终浓度为5 nm 。用5 µL 2％停止溶液（0.2％SDS ，30％甘油
，150 mM EDTA，Bromophenol Blue）和1 µL蛋白酶K（Roche ，18.4 mg ML -1）停止反应
，并在37°C下孵育10分钟
。为了防止在剥夺过程中检测到自发退火，在2％的停止溶液中包括了25倍过量的未标记寡核酸1寡寡核酸1。这些产品的解析和成像与放松测定法相同 。 　　为了研究Helq和Rad51之间的相互作用 ，在300 mL昆虫细胞中表达MBP-HELQ-FLAG杆状病毒
，并根据蛋白质纯化程序所述制备了来自收集到的颗粒的可溶性提取物
。将用于制备可溶性提取物的试剂量相应地缩放。将可溶性提取物平均分为两个部分，并与链淀粉（E8021 ，NEB）和抗flag M2树脂（A2220
，Sigma-Aldrich）在4°C下孵育1小时 。接下来，将淀粉酶树脂和抗flag M2树脂用洗涤缓冲液I（50 mm Tris-HCl pH 8.0 ，1 mm DTT，310 mm NaCl
，10％甘油，1 mm PMSF）洗涤
。在分离的微管中 ，将两个树脂分为50 µl体积。将4 µg重组RAD51添加到所有管子外
，每个树脂的一个管子除外，并在4°C下孵育1小时 。用洗涤缓冲液II洗涤树脂（与洗涤缓冲液I相同 ，但含有100毫米NaCl）。通过在95°C煮沸4分钟
，从1×SDS缓冲液中从树脂中洗脱蛋白质
。洗脱株用4-12％的天然SDS-PAGE凝胶（Nupage Bis-Tris，Invitrogen）分离 ，并用瞬时的蓝色Coomassie蛋白染色（ABCAM）染色。 　　捕获测定在20 µL DNA退火缓冲液中进行
，并补充了0.05％Tween-20 。将反应组装在冰上，并在指示的情况下 ，将82 nm RPA
，10 nm生物素化的DT43（Bio-DT43）和10 nm 3'Cy3 – dt79添加到反应中
。接下来，如所示 ，将螺旋添加到反应中。在黑暗中将反应在37°C下在37°C下孵育8分钟 。在下拉生物– DT43中，将磁链霉亲和素珠用PBS-0.1％Tween-20（Dynabeads M-280
，Thermo Fisher Scientific）洗涤两次，并将5 µL珠子添加到每个反应中
。在室温下在黑暗中进一步孵育4分钟 ，然后用80 µL洗涤缓冲液（25 mm Tris-HCl pH 8.0
，2 mm ATP，2 mM MGCl2 ，2 mm MMGCL2
，1 mm DTT，100 mM NaCl ，0.5 mg Mg Ml-1 ML-1牛奶-1牛奶血清白蛋白
，NP-40）在磁性机架上。最后，将珠子重悬于30 µL加载缓冲液（7.5 µL 2％停止溶液和22.5 µL洗涤缓冲液）中 ，并在95°C煮沸4分钟 。将样品高速离心1分钟
，并在10％天然聚丙烯酰胺凝胶上立即加载25 µL的体积样品，并按照对放松测定的描述进行运行
。将凝胶直接成像在Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）中。 　　使用市售的C-Trap（Lumicks）设置进行实验 。首先用BSA（PBS中的0.1％（w/v））和Pluronics F128（PBS中的0.5％（w/v））对微流体芯片的蛋白质通道进行钝化 ，并且使用前最低500 µL
。如前所述制备生物素化的ssDNA前体33。为了产生间隙λDNA，使用了先前描述的协议9 。简而言之
，将生物素化发夹寡核苷酸退火至λ-DSDNA末端并结扎34。链球菌为链球菌Cas9 D10a nickase（IDT）与先前描述的16指南RNA结合在一起，以生成靶向的DNA痕迹
。然后将反应存储在4°C下 ，并在实验当天直接在PBS中稀释。使用层层流量细胞以0.005％（w/v）捕获4.5μm的Sphero链霉亲和素涂层的聚苯乙烯珠
，并以100 pn的力（对于ssDNA）或65 pn（λ-GDNA 4/5）保持延伸并保持 。通过与内置自由连接的链模型进行比较来验证ssDNA和/或ssDNA间隙的存在
。对于共聚焦成像，使用了三个激发波长-EGFP和Alexa Fluor 488 ，532 nm的Cy3和Cy5的638 nm
，对于CY5，在三个通道中检测到蓝色滤镜512/25 nm ，绿色滤镜585/75 nm和红色滤镜640 lp。 　　对于所有放松测定
，λ-GDNA 4/5构建体的恒定力为50 pn 。实验期间，将珠和DNA保存在PBS中 ，而DNA在0.5×NTM缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5
，50 mM NaCl，0.5 mM MGCL2）中融化 ，并补充了0.2 mg ML-1 BSA和1 mM DTT
。将Helq（50 nm）和/或25 nm Rad51（A488）以1×螺旋缓冲液（25 mm Tris-HCl pH 8.0，2 mm mgcl2
，50 mm NaCl）流到系统中，并补充了2 mm ATP ，0.2 mg MG ML-1 BSA和1 mm DTT。随着时间的推移
，珠子之间的距离的变化可以监视放松 。为了直接对荧光RAD51进行映像，使用了以下图像采集设置：4 µW蓝色激光功率 ，0.1 ms PX-1停留时间
，100 nm像素大小，1 S间框架等待时间
。 　　在剥离测定中 ，使用光学镊子
，将λ-GDNA 4/5构建体保持在熔化后对应于10 pn力的距离。在实验期间（微流体通道1和2）将珠和DNA保存在PBS中，而DNA在PBS（微流体2频道2）中融化 ，然后与5 nm RPA-EGFP或100 nm RAD51和100 NM ALX-RAD51和100 nm alx – RAD51的混合物在1×25MMMMMMMM MM TRIS（25MM MM TRIS）中孵育 。50 mM NaCl), 0.2 mg ml−1 BSA and 1 mM DTT in channel 3. Once RPA–eGFP or Alx–RAD51 were assembled on λ-gDNA 4/5 (after ~2 min of incubation) beads with DNA were moved to channel 4 containing 50 nM HELQ in 1× HELQ buffer (25 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM MgCl2, 50 mMNaCl）补充了2 mM ATP
，0.2 mg ML -1 BSA和1 mM DTT
。随着时间的推移，监测RPA – EGFP或ALX -RAD51信号消失。图像采集设置如下：1.6 µW蓝色激光功率 ，0.1 ms px -1停留时间，100 nm像素大小
，1 s Interframe等待时间 。 　　对于所有放松测定，λ-SSDNA均以10 pn的恒定力保持。实验过程中 ，将珠和DNA保存在PBS中
，而DNA在0.5×NTM缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM NaCl，0.5 mM MGCL2）中融化 ，并补充了0.2 mg ML-1 BSA和1 mm DTT
，在5 nm RPA – Egfp的情况下
。HELQ（5 nm），5 nm RPA – EGFP和2 nm 5'Cy3-（λ4）80寡核苷酸（5'-Cy3-CCTGAACGACGACCAGGCGCGCGCGTCTTC GTTCATCATCATCTATCTATCTATCGGGATCG CCACACTCACACACACACTCACA ACAATGAGTG GCAGAGAGTG GCAGAGATATAGCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTMNM5′Cy3-dT79 oligonucleotide (5′-Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′) was flowed into the system in 1× HELQ buffer（25 mM Tris-HCl pH 8.0 ，2 mM MGCl2
，50 mM NaCl）补充了2 mM ATP，0.2 mg ML-1 BSA和1 mM DTT。为了直接对荧光寡核苷酸的捕获进行图像 ，使用了以下图像采集设置：0.75 µW绿色激光功率
，0.1 ms px-1停留时间，100 nm像素大小 ，0.5 S Interframe等待时间 。 　　实时力，距离和荧光数据是从Bluelake HDF5文件导出的
，并使用Pylake Python软件包中的自定义脚本进行了分析
。将力降低到3 Hz以进行绘制。用于λ-dsDNA的蠕虫样链模型用作力 - 扩展曲线比较的参考 。在GraphPad Prism 7中处理珠距离 - 时间迹线
。进行痕迹的第一派生和平滑以提取单个放松的中风率。通过拟合单个或双高斯曲线，在GraphPad Prism 7中分析了中风率分布 。在斐济估计了停留时间和结合频率
。在GraphPad Prism 7中分析了停留时间频率分布。使用Mann – Whitney U检验来评估数据的统计显着性 。 　　对于位置 ，速度和均方根位移（MSD）分析（扩展数据图4i – k）
，我们在Python（https://github.com/singlemoleculegroup）中使用了定制制造的单粒子跟踪算法
。通过将三框移动窗口的信号强度与1D高斯函数拟合（LineTime = 0.997 s，100 nm px-1）来计算荧光粒子在Kymograph中的荧光粒子的子像素位置。 　　对于获得的轨迹 ，使用以下公式计算MSD： 　　其中n是kymograph中的框架总数
，n是移动窗口（滞后时间）中计算方位移（范围为1至n -1）的帧数，而XI是时间沿DNA的分子位置 。 　　为了评估轨迹是代表随机行走还是定向运动 ，MSD依赖性拟合了功率定律。当MSD尺度具有指数α≤1时
，粒子表现出与速率D的自由或约束扩散
。当α> 1时，该过程的表征为超排期运动（例如 ，单向步行）。 　　为了估计易位分子的平均速度
，分子的总途径（框架到框架位移的总和）除以总轨迹时间 。在这里，使用Savitzky -Golay滤波器（平滑因子= 51）平滑每个轨迹 ，以消除跟踪不准确性和分子的热波动
。 　　为了估计Helq-RPA – DNA复合物形成的环大小，在力 - 距离曲线中每个展开事件后的轮廓长度由蠕虫样链模型拟合。相邻事件的轮廓长度之间的差异与循环大小相对应 。 　　如前所述
，制备流室1,2
。用聚乙二醇（5％的生物素化）钝化了石英载玻片和盖玻片，并使用双面粘胶带构建流室 ，并用环氧树脂密封。5'-生物素和内部氨基连接器修饰的DNA寡核苷酸用CY3-NHS酯标记
，并如前所述纯化HPLC纯化3 。DNA（下午6点）通过生物素 - 链霉亲和素相互作用固定
。所有实验均在标准的螺旋缓冲液中进行，并添加了具有5 mm PCA ，100 nm PCD和饱和Trolox的PCA/PCD氧气清除剂系统。将流室成像为基于棱镜的总内反射显微镜
，具有532 nm的激发激光器（〜3.8 mW），并在30 ms的接触时间上在EM-CCD摄像头（Andor）上获取图像 。从综合供体（ID）和受体（IA）强度计算为FRET = IA/（ID+IA）（参考文献1,3） ，将FRET效率计算出来
。使用自定义IDL
，MATLAB和R脚本分析图像和数据，可应要求提供。通过平均每个轨迹的前10帧 ，bin为0.1
，构建了FRET效率直方图 。测量了自由（高品格）和结合（低点）状态的停留时间，并绘制了停留时间直方图。这些与单个指数拟合相吻合以获得平均停留时间
。 　　U2OS人骨肉瘤细胞系在补充了10％牛生长血清 ，2 mM-谷氨酰胺，100 µg ML -1链霉素和100 U ML -1青霉素的DMEM中生长。将U2OS-EJDR细胞培养在补充有10％四环素胎牛血清
，2 mM-谷氨酰胺，100 µg ML-1链霉素和100 U ML-1青霉素的DMEM中 。如前所述 ，U2OS-DR细胞包含一个稳定的集成DR-GFP报告基因
，可通过HR测量DSB修复
。如前所述，U2OS-SA细胞包含一个稳定的集成SA-GFP报告基因 ，用于测量SSA的DSB修复。如前所述36 。如前所述37
，含有诱变的末端结合的U2OS-DR细胞构成了诱变的末端 - EJDR细胞系，以测量诱变的末端末端构成DSB修复
。U2OS-RFP-SCR细胞包含一个稳定的集成的RFP-SCR报告基因 ，用于量化HR中的STGC和LTGC
，如前所述38。 　　使用CRISPR-CAS9系统生成U2OS-DR Helq - / - 和U2OS-SA螺旋 - / - 细胞 。使用Sanger测序和免疫沉淀/Western印迹验证了敲除
。 　　以下siRNA寡核苷酸用于瞬时耗尽螺旋：Helq 1（Qiagen flexitube siRNA，SI00435449）；Helq 2（Horizo​​n Sigenome SmartPool ，M-015379-01-0005）;Helq 3（Helq_m23; Caaaggaagatttcctccaactaaa）。 　　RAD52使用靶标和智能池SIRNA L-011760-00-0005（地平线）耗尽 。BRCA2使用靶标和智能池SIRNA L-003462-00-0005（Horizo​​n）耗尽
。目标加上非目标siRNA池用于非目标控制（D-001810-10-05
，Horizo​​n）。 　　根据制造商的说明，使用Lipofectamine Rnaimax试剂（Invitrogen）将细胞（0.25×106）用30 pmol siRNA反向转染 。48小时后 ，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将细胞用2μgPCMV-ISCEI-3×NLS或PCMV 3×NLS空载体和30 pmol siRNA转染。使用LSR Fortessa仪器（BD Biosciences）在72小时时通过流式细胞仪收集细胞进行分析
。对于每个实验，从I-SCEI转染的细胞中减去了空载体控制中的GFP或RFP阳性细胞的百分比。每个记者测定的数据代表平均值±S.E.M.在至少三个独立的实验中
，使用两尾配对t检验进行了统计分析 。CAS9介导的DSB修复测定法用于引入CAS9介导的位点特异性DSB，并使用下一代测序检测到断裂修复结果 ，如前所述39
。简而言之
，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）在PX330（Addgene质粒，72833）中用AAVS1 T2 CRISPR转染细胞 ，并在48小时后提取基因组DNA。为了测量SSTR
，与CRISPR质粒共转染了1 µL 10 µm 121 bp供体寡核苷酸（从IDT购买） 。涵盖预期CAS9断裂位点的201 BP PCR扩增子进行了下一代测序，并分析了读取 ，删除和替换的读数
。NHEJ定义为1-5 bp的缺失
，MMEJ为> 5 bp缺失，至少为2 bp微学学 ，而SSTR则是引入三个1 BP取代。数据代表平均值±S.E.M.在至少四个独立的实验中
，并使用两尾配对t检验进行了统计分析 。 　　将细胞与停止的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific Sc​​ientific）中的RIPA缓冲液（Teknova，R3792）裂解
。由于螺旋在人体细胞系中的低水平表达 ，并且测试的市售抗体无法通过蛋白质印迹可靠地检测到内源性螺旋螺旋，因此我们使用Helq免疫沉淀验证了siRNA介导的Helq敲低。使用Amaxa核对象系统通过电穿孔将细胞（106）用2 µg siRNA转染
，并将细胞镀入150毫米菜肴 。72小时后，收集细胞 ，并将全细胞提取物用于免疫沉淀
。将蛋白质（2 mg）与1 µg抗螺旋308抗体（Novus Biologicals
，NBP1-91842）在4°C下孵育过夜，过夜过夜。洗涤0.25 mg Pierce蛋白A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific ，88802）后
，将抗原样品 - 抗体混合物添加到珠子中，并在室温下旋转在室温下孵育1小时 。将珠洗涤四次 ，并在SDS页面减少样品缓冲液（Invitrogen）中
，在96°C下持续10分钟。将样品加载到SDS-凝胶电泳的4–12％BIS-Tris预制凝胶（Invitrogen）上，并转移到Immobilon-P PVDF膜（Millipore）上
。在室温下 ，用刺穿透明的牛奶阻塞缓冲液在室温下阻塞膜1小时。对于Rad52和BRCA2的蛋白质印迹分析
，将50μg的蛋白质加载到10％BIS-TRIS或3–8％Tris-乙酸酯预制凝胶（Invitrogen）上，用于SDS-凝胶电泳 。将蛋白转移到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（Biorad）上 ，以进行BRCA2检测
。IBLOT凝胶转移系统（Invitrogen）用于执行蛋白质在硝酸纤维素膜上进行干燥，以进行RAD52检测。在室温下
，用刺穿透明的牛奶阻塞缓冲液在室温下阻塞膜1小时 。蛋白质印迹分析的抗体如下：抗HEL308（Santa Cruz Biotechnology，SC-81095） ，抗RAD52（Santa Cruz Biotechnology
，SC-365341），抗BRCA2 AB-1（Millipore Sigma-Aldrich ，op95）
，Anti-Aldrich，Op95） （Bethyl Laboratories ，A300-055A）
。 　　siRNA转染后72小时收集细胞。根据制造商的说明
，使用Invitrogen的Taqman基因表达细胞到CT KIT进行细胞裂解，逆转录和定量PCR 。TAQMAN基因表达测定（HS01127906_M1）和ACTB内源对照（HS999999903_M1）在QuantStudio 6 Pro实时PCR仪器（Applied Biosystems）上以一式三份运行
。使用∆ΔCT方法计算相对倍数基因表达。数据代表平均值±S.E.M.在至少三个独立的实验中 ，使用两尾配对t检验进行了统计分析 。 　　将WT U2OS-DR和Helq - / - U2OS-DR细胞接种到四腔组织培养载玻片（Millipore）上
，并在第二天用4 µM camptothecin或10 Gy辐照进行处理
。对于siRNA敲低，将细胞用非靶向或螺旋siRNA转染 ，过夜孵育并在第二天播种到腔室滑动。siRNA转染后48小时用指定的损伤剂处理细胞 。在指定的时间点，将细胞固定
，阻塞和透化。用以下抗体染色细胞：抗磷酸化的H2A.X（Ser139）（05-636，Millipore Sigma-Aldrich） ，抗Rad51（PC130 Millipore Sigma-Aldrich）（AB87277
，ABCAM）
。次级抗体如下：Alexafluor 488标记的山羊抗兔IgG，Alexafluor 568标签的驴抗小鼠IgG ，Alexafluor 568标记的山羊抗Rat（Invitrogen）。使用Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜获得图像
，并使用ImageJ进行分析 。根据实验计数至少100个核，并将> 5焦点的核评分为阳性
。数据代表平均值±S.E.M.在至少三个独立的实验中 ，使用两尾配对t检验进行了统计分析。 　　Chemidoc MP图像实验室触摸软件（Bio-Rad
，V.2.2.0.08）用于凝胶成像 。使用ClarioStar BML LabTech（V.5.20 R5）收集了基于淬火的动力学放松测定数据
。Lumicks的Bluelake软件用于SMI（Lumicks）的数据收集。同样，对于基于SMFRET的测定 ，使用了来自ONI的NIMOS软件 。BD FACSDIVA软件与BD Biosciences LSR Fortessa分析仪一起用于流式细胞仪数据采集
。ZEN 2.3 SP1 FP3（黑色）V.14.0.18.201用于共聚焦显微镜图像采集。 　　使用ImageJ（NIH V.1.52K）进行基于凝胶数据的量化 。MARS数据分析软件（BML LabTech v.3.10 R6）用于基于淬火的动力学放松测定
。为了通过光学镊子分析SMI
，使用了Lumicks的Pylake软件。此外，使用自定义脚本来分析SMI（https://github.com/singlemoleculegroup）进行的一些放松/易位测定 。使用ISMS软件（开源）39进行SMFRET分析。为了进行显微镜数据分析 ，使用了图像J（NIH，V.1.53E）
。QuantStudio设计和分析软件V.2与QuantStudio 6 Pro实时PCR仪器一起用于相对基因表达分析。使用BD FlowJo（V.10.6.2）分析流式细胞仪数据 。FlowJo用于栅极单细胞
，然后根据所示测定法选择GFP+和/或RFP单元
。从每个实验中减去了来自未转染的对照的背景信号。FlowJo的代表性图在补充图2中提供了传输策略 。CAS9DSB维修测定测序数据如Hussain等人40所示，使用Pear Software用于读取缝线 ，Blosum62
，用于对准的缝制和代码，用于微学分学/DELETION/DELETION分析（htttps://github.com/cjsifuen）/cjsifuen/cjsifueen/cjsifueen/cjsifueen/cjsifueen/使用GraphPad Prism（V.8.2.1和V.8.4.2）进行统计分析
。除了使用Adobe Illustrator v.2.3生成了基于淬火的动力学放松测定法的所有原理图。对于基于淬火的动力学放松测定的示意图 ，使用了biorender.com 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。