MSL2确保哺乳动物中的双重基因表达

　　所有小鼠都保存在马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所的动物设施中。将小鼠维持在没有特定的病因条件下 ，其中有2至5只小鼠在单独通风的笼子中（Techniplast） 。笼子配备了床上用品，筑巢材料
，纸屋和隧道，以增加舒适感。仔细调节住房环境 ，光周期由14小时的光周期
，然后是10小时的黑暗
。环境温度保持在22±2°C，湿度保持在55±10％。此外 ，使用隧道处理小鼠以最大​​程度地减少压力并确保其幸福感 。根据《德国动物保护法》第4（3）条对小鼠进行安乐死
，所有动物实验均根据德国Regierungspräsidiumfreiburg批准的相关指南和法规进行（许可AZ
。35-9185.82/I-17/03/03/03和AZ。对于雌性CABL ES细胞的产生，使用了8周龄的铸菌/EIJ雌性小鼠和8周旧的C57BL/6J雄性小鼠 。使用CRISPR-CAS9核酸内切酶介导的基因编辑产生了MSL2-NULL等位基因（MSL2EM1AKH ，称为MSL2 - / - ）
。用SGRNA靶向MSL2（5'-ACGTTTCTCTCGACGGCG-3''和5'-TTAGGCGGACTTCGAACTAG-3'）的核糖核蛋白复合物20,35和Cas9蛋白使用使用标准卵母细胞的fvb/n pronuclei注入FVB/N pronuclei。FVB/N受精卵母细胞是通过与8周大的FVB/N雄性小鼠交配8周的FVB/N雌性小鼠获得的 。将所得的小鼠进行基因分型
，并在9：101075407–101076131（MM10）的外显子1和内含子1和内含子1的交界处确定为725 bp的缺失
。该线将至少十代回到C57BL/6J背景中，以获得B6.FVB-MSL2EM11AKH/MPIE小鼠 ，并保持为杂合子 （称为MSL2 - /+小鼠）没有负担。使用置于缺失区域（5'-CCGGGGAGCCATTGGTGTCGAAG-3'和5'-GGACATGGCTGTGCATGCATGCCTGACCTGA-3'）的引物进行基因分型 。 　　在补充有LIF（Millipore）
，2i抑制剂（PD0325901和CHIR99021，干燥剂）的NDIFF 227培养基（Takara）中培养从A. ferguson-Smith获得的雄性小鼠ES细胞 ，分别为1 µm和3 µm
。Female mouse 9sCa ES cells obtained from E. Heard were cultured in 2i medium (KnockOut-DMEM (KO-DMEM, Gibco) supplemented with 15% KnockOut Serum Replacement (KOSR, Gibco), GlutaMAX (Gibco), non-essential amino acids (Gibco), sodium pyruvate (Gibco), 2-mercaptoethanol (Gibco), LIF and 2i抑制剂）。定期检查所有细胞系是否有支原体污染 。 　　我们通过自然1至1个持久的cast/eij雌性和8周旧的C57BL/6J雄性小鼠产生了女性CABL ES细胞。指定E0.5的当天中午被指定为e0.5
。在E2.5时，将胚胎冲洗并置于KSOM（Cosmobio）+2i培养基与卵巢（Vitrolife）的微角培养物中
，并在37°C和5％CO2孵化器中孵育2天。然后将胚泡转移到2i培养基中的NUNC 4孔板中，并孵育1天 。使用Tyrode的酸性溶液去除Zona pellucida
。通过免疫外科分离内部细胞质量（ICM） ，然后将细胞在2i培养基中的固定因子涂层（Gibco）四孔板中培养3-5天。一旦ICM聚集体达到最佳尺寸
，将使用ACCUTASE（Invitrogen）机械分解细胞，并如上所述进行培养 。 　　如前所述46,47 ，雄性CABL/BLCA和雌性CABL ES细胞分化为NPC
。In brief, 1 million ES cells were plated onto 0.1% gelatin-coated plates in N2B27 medium, consisting of 1:1 DMEM/F-12 (Gibco) and Neurobasal medium (Gibco), supplemented with B27 (Gibco), GlutaMAX (Gibco), 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), apo-transferrin（Sigma-Aldrich）
，牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich），胰岛素（Sigma-Aldrich） ，penrescine（Sigma-Aldrich）
，孕酮（Sigma-Aldrich）和硒钠（Sigma-Aldrich）。7天后，将细胞解离 ，并在存在10 ng ml-1表皮生长因子（EGF
，peprotech）和10 ng ML-1碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2，peprotech）的情况下将细胞铺在非粘附培养皿上 。3天后 ，将胚胎体转移到明胶涂层的板上，以实现NPC的膨胀
。将NPC培养在含明胶涂层板上的EGF和FGF的N2B27培养基中。本研究中使用的9SCA NPC通过E. Heard5获得 。它们是根据相同协议生成的
。 　　为了生成MSL2 KO细胞
，将两个引导RNA（GRNA）克隆到PX-459衍生物（PSPCAS9（BB）-2A-PURO）质粒中（Addgene，62988）48。根据制造商的说明 ，分别使用Amaxa P3、4D-核对象（LONZA）分别转染男性和雌性ES细胞和NPC 。在48–72小时后
，将单细胞分为96孔板，使用MOFLO XDP细胞分选仪或BD ARIA Fusion II系统获得单细胞克隆。通过在裂解缓冲液（10 mM Tris pH 8.0 ，0.5 mM乙二胺二氨基乙酸乙酸（EDTA）
，0.5％Triton X-100）中分离出来自单个克隆的基因组DNA（GDNA），并在55°C下于55°C孵育
。以16,000克离心10分钟后收集GDNA。使用2×PCR主混合（Qiagen）以10μL的最终体积进行PCR 。根据制造商的说明 ，使用CloneJet PCR克隆（Thermo Fisher Scientific）和Bigdye Direct Sanger测序（Thermo Fisher Scientific）套件对成功的KO进行了验证
。补充表8中提供了GRNA序列。使用侧面删除区域（5'-CaacagaAcctccgccg-3''和5'-CcagttaacacacgagagtcatCatCACCCC）进行基因分型 。定期检查所有细胞系是否有支原体污染
。补充表1总结了MSL2-KO克隆的数量。值得注意的是
，并非使用下一代测序分析本手稿中产生的每个克隆 。补充表1中提供了本手稿中生成的所有数据集
。 　　MSL2（H64Y）突变雄性CABL ES细胞克隆是使用同源指导修复（HDR）通过Alt-R-R CRISPR – CAS9（Integrated DNA Technologies，IDT）核糖核蛋白（RNPS）（RNPS）和先前对一些模拟物进行描述的单链核氧化核苷酸和单一含寡核苷酸的核糖核蛋白（RNPS）（RNPS）（RNPS）的核糖核蛋白（RNPS）（RNPS）。简而言之 ，使用1.1 µL自定义合成的MSL2H64Y CRRNA（100 nm
，iDT），1.1 µL TRACRRNA-ATTO 550（100 nm ，idt）和1 µL Pyogen pyogen pyogenes pyogenes cas9 cas9 nuclease V3（10 µg µl-µl-µl -1，IDT）形成RNP 。使用4D-核对象系统（LONZA）和P3主要细胞4D-核型X KIT S（LONZA）将RNP传递到ES细胞
。简而言之
，将3.2 µL的RNP混合物，1 µL电穿孔增强剂（100 nm ，idt）和1μl自定义SSODN HDR模板（100 nm
，idt，alt-r修饰）与约有180万ES细胞混合在20 µL P3主细胞燃料中（LONZA）。将CG-104程序的一个脉冲应用于Nucleocuvette（20 µL格式 ，LONZA）的悬浮液 。立即将细胞转移到12孔细胞培养板中的明胶涂层孔中
，其ES细胞培养基补充了HDR增强剂（IDT）。第二天，将培养基与常规ES细胞介质补充
。48小时的核反射后 ，使用MOFLO XDP细胞分辨率（Beckman Coulter）对细胞进行分选。通过限制片段长度多态性（RFLP）分析和Sanger测序在筛选后选择阳性克隆 。HDR模板旨在引入两个额外的静默点突变
，以减少正确编辑的细胞中RNP的重新出现以提高HDR效率50，并引入SCAI限制位点以启用RFLP分析
。通过使用Quickextract DNA提取溶液（Lucigen） ，使用H64Y位点的534 bp区域的PCR扩增RFLP分析
，使用HFIDELITY PCR MASTER与HF Buffer（NEB）和SCAI酶（NEB（NEB））对H64Y位点周围的534 bp区域进行了PCR扩增进行RFLP分析。 PCR扩增子和琼脂糖凝胶电泳的消化 。根据制造商的说明，Bigdye Direct Sanger测序（Thermo Fisher Scientific）确认了RFLP阳性克隆的PCR扩增子的序列
。序列在补充表9中提供。定期检查所有细胞系是否有支原体污染 。 　　9SCA ，BLCA和CABL WT和MSL2-KO NPC用DBET6在100 nm（参考51）的1 、6或12小时用DBET6处理，并处理细胞以逆转录（RT-QPCR）进行定量PCR
。9SCA WT和MSL2-KO NPC中的KANSL1敲低是通过对Kansl1（Sikansl1 1：s2335220
，5'至3''至3'的Sikansl1 1：ccauuuagcccagaacuacatt，antissense：ugaucggggggggggggggc ，S2335221
，5'至3'的感觉：gcaauaaucuacuaaggatt，反义：uccuuaguaggauuauauugcgg; sikansl1 3：s2335222 ，5'添加或添加TG碱基以达到siRNA稳定性）
，而消音器选择1号siRNA的阴性对照。根据制造商的说明，使用4D-核对象系统（LONZA）和P3初级细胞4D-核对象X KIT S（LONZA）将siRNA交付给NPC 。将DN-100程序的一个脉冲应用于含有siRNA（1μM）和1 µL的电穿孔增强剂（100 nm ，idt）的细胞悬浮液中
，以核维特（20 µL格式，lonza）
。将细胞铺在明胶涂层的六孔板上 ，并第二天用常规NPC培养基补充培养基。然后
，在核能后72小时收集细胞并处理RT – QPCR 。 　　从P. M. Campeau获得的原代人成纤维细胞系（F0062.1）源自37岁男性的皮肤活检。将细胞培养在补充了10％FC和100 U ML -1青霉素和100μgml -1链霉素（Gibco）的谷氨酸（Gibco）中，在37°C下 ，在5％CO2下，在受控的孵化器中
。细胞系测试了乙型肝炎
，丙型肝炎，HIV ，人疱疹病毒4和8的阴性
，并且不含支原体。成纤维细胞以约90％的汇合度传递 。 　　如前所述46,47，雄性NPC分化为神经元 ，并进行了一些修改
。简而言之
，在第0天，每孔150,000个NPC被铺在多赖斯糖涂层（0.1 mg ml-1 ，Gibco）的六孔组织培养板（Corning）的N2B27培养基中
，并补充了5 ng ML-1的基本成纤维细胞生长因子（FGF-2，PEPROTECH ，pepRotech）和7天
，并在7天中进行了7天，并在7天中进行了7天 ，并在7天中进行了不同。将培养基替换为没有FGF-2的N2B27培养基，并在第9、11和13天更换了一半的培养基
，将神经细胞进一步成熟7天 。 　　MSL2 - / - ，MSL2 +/-和MSL2+/+胚胎（E11.5至E18.5）以及MSL2 +/-和MSL2+/+P0.5小鼠通过MSL2 +/-雌性（年龄为2至6个月）和MSL2 +/-男性（MSL2 +/-雄性（Ag -age）男性（年龄为2至6个月） ，通过定时交配来产生
。在检测到交配雌性的阴道塞的当天中午被指定为E0.5。由于缺乏预期知识
，未预先确定用于表征MSL2 - / - 和MSL2 +/-小鼠的样本量 。鉴于在P0.5处的MSL2 - / - 小鼠意外缺乏，一旦通过χ2test52偏离了预期的基因型比率 ，则停止使用P0.5的额外小鼠的产生以减少动物总数
。用于计算产前基因型比率的动物也用于其他各种实验（器官收集
，然后进行下游分子分析；未发表的数据），从而导致使用的动物总数。对于E18.5胚胎的表型评估 ，一旦MSL2 - / - 
，MSL2 +/-和MSL2+/+胚胎之间的差异达到了统计学意义，则使用Fisher的精确测试确定了统计学意义 ，就会停止胚胎的产生
，以减少动物的总数 。 　　E18.5胚胎的表型和严重程度评估（无，轻度或重度）是由对基因型视而不见的实验者进行的
。如果胚胎的器官误导或出血 ，则将表型评估为严重。轻度的表型包括眼睛学生的较小异常模式 。源数据中包括每个E18.5胚胎的基因型和表型细节。 　　根据制造商的说明，使用亚细胞分级试剂盒（Thermo Fisher Scientific）制备蛋白质提取物
。通过Qubit（Thermo Fisher Scientific）定量核和染色质蛋白分数。对于Western印迹加载
，将4倍旋转负载减少加载缓冲液（Carl Roth）添加到大约2-5μg蛋白样品中，然后将其煮沸10分钟 。在1×MOPS缓冲液中使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Invitrogen）分离蛋白质 ，并转移到0.2μm聚依依替二氟化物膜（ROCHE）中
，在1倍转移缓冲液中（25 mm Tris-HCl（pH 7.6），192 mm Glycine ，10％Methanol）中的1倍转移缓冲液（25 mm Tris-Hcl（pH 7.6）
，4）
。将膜在0.1％1×PBS中的5％牛奶（Biomol）中阻塞0.3％Tween-20（PBST），持续1小时 ，然后在4°C下与一抗初级抗体一起孵育过夜。使用Lumi-Light Western印迹底物（Roche）或FEMTO（Invitrogen）（Invitrogen）使用Lumi-Light Western印迹底物（Invitrogen）使用HRP偶联的二级抗体
，并使用Bio-Rad Imager进行了可视化 。如有必要，使用Restore Plus Western印迹剥离缓冲液（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的说明将蛋白质印迹剥离 ，并用新的原代抗体重新拍摄
。补充表10中提供了抗体列表。 　　根据制造商的指示
，使用WT和MSL2-KO雌性NPC或WT和MSL2 H64Y突变体CABL雄性ES细胞的核蛋白分数使用亚细胞蛋白分馏试剂盒（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的指示分离 。通过Qubit（Thermo Fisher Scientific）定量蛋白质水平，并使用相等的量
。在免疫沉淀之前 ，将琼脂糖蛋白A珠（Roche）用HMG-150缓冲液洗涤（25 mM HEPES pH 7.6，0.15 m kcl
，5 mM MGCL，MGCL2 ，0.5％Tween-20
，0.2 mg 20，0.2 mg mg ml-1 bsa） ，随后将其用于蛋白质的蛋白质进行30分钟
，以进行30分钟的precein dection 4°°°C in n Min criends in 4°°°C。收集预知的提取物并补充5μg抗体或IgG对照，并在4°C下旋转过夜 。第二天 ，将洗涤后的琼脂糖蛋白A珠添加到提取物中
，并在冷房间中旋转1.5小时
。收集珠子并用HMG-150缓冲液和HMG-300缓冲液（25 mM HEPES pH 7.6，0.3 m kcl ，5 mM MGCL2
，5.5％Tween-20，0.2 mg 20 ，0.2 mg ml-1 bsa）洗涤两次。通过在70°C下孵育10分钟，使用2×旋转载荷减少加载缓冲液（Carl Roth）从珠子中洗脱结合的蛋白质络合物 。补充表10中提供了抗体列表。 　　根据制造商的说明
，使用Direct-Zol RNA Miniprep Plus Kit（Zymo Research）提取总RNA
。在指示的情况下，在继续进行第一链cDNA合成之前 ，将10％的果蝇RNA升入。根据制造商的指示
，使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）或Promega GoScript逆转录系统（Promega）从总RNA中合成cDNA 。使用FastStart Sybr Green Master（Rox）混合（Roche）在Roche Lightcycler II系统上进行RT – QPCR，最终体积为10μl
。补充表9中提供了引物序列的列表。对于RNA-Seq实验 ，在库制备之前
，使用片段分析仪（Agilent Technologies）分析了RNA质量 。根据制造商的说明，使用带有Ribo-Zero Plus套件（Illumina）的滞留的RNA Prep（Illumina）的总RNA Prep制备了总RNA-seq库
。每个样品的三个技术重复（WT ，KO1
，KO2）被测序。 　　对于胚胎小鼠，使用细尖端的镊子将E18.5胚胎胎盘和大脑解剖 。通过从母体子宫和deci酸组织中去除和清洁胚胎的胎盘组织
。将大脑清除并从头骨和硬脑膜上清洗。在无RNase管中的液氮中立即在液体氮中立即将每个组织固定在-80°C下 。对从尾部组织提取的DNA进行了基因分型
。稍后 ，根据制造商的说明
，使用直接-Zol RNA MicroPREP KIT（Zymo Research）从冷冻组织中提取RNA。 　　为了验证杂交NPC中的基因表达变化，如上所述 ，生成了9SCA，BLCA和CABL WT和MSL2-KO NPC的cDNA 。在Sanger测序之前
，在MSL2-Targget基因（MECP2和ZKSCAN16）的转录本中，铸件与C57BL/6之间包含单核苷酸多态性（SNP）的感兴趣区域通过prusion ii dna Polymase System（MSL2-TARGET基因（MECP2和ZKSCAN16）的转录）进行了PCR（MECP2和ZKSCAN16）（ZKSCAN16）（ZKSCAN16）（ZKSCAN16）。5'-catacttccagcagcagatc;使用凝胶DNA回收试剂盒（Zymo Research）纯化PCR产物
。根据制造商的说明 ，使用Applied Biosystems Bigdye终结器v3.1循环测序试剂盒制备了PCR产品
，以使用相同的引物对，用于放大感兴趣的转录区域。在3130遗传分析仪（Applied Biosystems）上对样品进行了测序 ，并使用Snapgene v.5.3.2软件分析了序列 。 　　如前所述53进行TT-Seq
。简而言之
，将1000万个NPC与补充的N2B27培养基孵育，并在37°C下在37°C下孵育500μm的4-硫代氨酸（4SU ，Sigma-Aldrich）5分钟。将总RNA分离出来
，使用Bioruptor Plus零散1分钟（30 s ON，30 s左右 ，高设置）
，并与Biotin-HPDP（Thermo Fisher Scientific）孵育2小时 。Myone C1链霉亲和素磁珠（Thermo Fisher Scientific）用于在5％β-马capto乙醇（Carl Roth）中洗脱之前，将RNA标记为RNA
。根据制造商的说明 ，使用Oligo Clean and Comentator套件（Zymo Research）清理最终RNA。根据制造商的说明，使用Ovation Univers RNA-Seq System（Nugen）从100 ng的高质量RNA制备库 。每个条件测序三个独立的重复
。 　　如前所述54进行ATAC – SEQ。简而言之
，通过在冰上孵育3分钟，将50,000个复制细胞的核分离在50μL的冷ATAC重悬式缓冲液（0.1％NP-40
、0.1％Tween-20和0.01％digitonin）中分离 。裂解后 ，添加了1 ml的ATAC重悬浮缓冲液
，其中含有0.1％Tween-20（无NP-40或Digitonin），然后将核以500G离心10分钟
。使用50μL的转座混合物（25μl2×TD缓冲液（Illumina） ，2.5μl转座酶（Illumina）
，16.5μl1×PBS，0.5μl1％Digitonin ，0.5μl10％Tween-20和5μl水）在37°C下进行换位。根据制造商的说明
，使用Zymo DNA清洁和浓缩剂（Zymo研究）收集转置DNA，并将添加到含有25μlNebnextMaster Mix（NEB）和5μL指数适配器（Illumina）的PCR混合物中 。使用以下PCR程序扩增库：72°C 5分钟；98°C 30 s;然后10个98°C的10个循环持续10 s ，63°C 30 s和72°C持续1分钟。在测序之前
，使用片段分析仪（Agilent Technologies）分析了图书馆质量
。每个条件测序三个独立的重复。 　　使用Accutase（Sigma-Aldrich）收集WT和MSL2-KO NPC，重悬于新鲜培养基中并放在冰上 。使用锥虫蓝色和血细胞计估计活力
。根据10倍基因组学指南（手册CG000365 REVB：单细胞多重ATAC +基因表达测序的细胞核分离）制备核 ，使用手册中指示的配方几乎没有修改。简而言之，将细胞沉淀重悬于1×细胞裂解缓冲液中
，补充了RNase A抑制剂（Sigma-Aldrich，3335399001） ，在冰上孵育8分钟
，然后用洗涤缓冲液洗涤两次（补充RNase A抑制剂） 。将核重悬于10倍基因组学稀释的核缓冲液（PN-200207）中，并补充了RNase抑制剂 ，并通过40 mM尖端过滤器（FlowMI细胞过滤器
，H13680-0040，BEL-ART）过滤
。使用血细胞计数仪对核进行定量 ，并调节至每升3,220个核。随后
，根据10倍基因组学用户指南CG000338 Rev B的指示，总共将5 l稀释的核用于转座酶反应 ，试剂盒“ Next Chromium Next Gem单细胞Multioe ATAC +基因表达 ”（PN-1000283-5）（PN-1000283-5） 。对于女性9SCA NPC
，每个克隆测序一个重复
。并且，对于雄性CABL和BLCA NPC ，每个克隆测序了两个独立的重复。 　　根据已发表的Relacs芯片seq方案55省略核条形码程序的转录因子芯片 。这里总结了染色质制备和消化的主要步骤：MSL2 WT和KO NPC在培养基中固定在1％甲醛中，并在室温下在摇摆板上孵育10分钟
。除去培养基
，并用补充1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的1×PBS洗涤细胞两次。将细胞从板上刮下，收集在冰冷的1×PBS中 ，并以500克离心5分钟 。额外的1×PBS洗涤后
，将细胞颗粒存储在-80°C下，直至使用。使用基于Nexson的核分离方案通过轻度超声处理分离核
。将细胞颗粒解冻在冰上 ，并重悬于冰冷的1 ml裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 8
，10 mM NaCl，0.2％igepal Ca-630 ，1×1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。然后将细胞悬浮液转移到1 ml毫升（Covaris）中
，并在Covaris仪器（E220）中超声处理30 s，在峰值功率75 W ，占空比2％和200个周期/爆发 。将细胞核在20°C下以1,000克的含量固定5分钟
。将上清液丢弃
，并仔细地将核弹重悬于0.5％的SDS中，并在室温下孵育10分钟 ，然后通过在最终浓度1.1％的1.1％加入Triton X-100来淬灭SDS。将1×切割的缓冲液和100倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒添加到染色质中，并在20°C下使用CVIKI-1（每100.000个细胞5 U
，R0710，新英格兰Biolabs）消化 ，持续16小时
，持续800 rpm 。染色质消化后，将细胞核在1,000g下固定5分钟 ，并在冷核洗涤溶液中洗涤（10 mM Tris-HCl pH 8
，0.25％Triton X-100，0.2 mg Ml-1 BSA） ，并储存在冰上
。为了确认酶染色质剪切效率
，将5％的核溶液与由蛋白酶K，降低溶液一起孵育 RNase A和5 M NaCl在50°C下30分钟 ，然后在65°C下孵育2小时。使用MineLute PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化DNA
，并使用HS NGS片段试剂盒（1-6,000 bp）试剂（Agilent）对5200片段分析仪系统（M5310AA）进行分析 。然后将消化的核裂解以执行转录因子芯片seq
。每个条件测序至少两个独立的重复。补充表10中提供了抗体列表 。 　　对高通量多路复用芯片seq进行了完整的Relacs WorkFlow55
。将消化的核以5,000g颗粒固定10分钟，并在10 mM Tris-HCl中每25μl的500,000核浓度归一化 ，pH 8。如Leasts Protocol55中所述，进行了核条形码 。简而言之
，将1.5μl的末端准备酶混合和3.5μl反应缓冲液从NEBNEXT ULTRA II DNA文库制备试剂盒（E7645L，NEB）中添加到细胞核中 ，然后在20°C下在20°C孵育30分钟
，然后在65°C的热灭活5分钟内孵育。随后，添加了1.2μl含有样品条形码的发夹适配器
。通过在Nebnext Ulta Ultra II DNA文库制备试剂盒（E7645L ，NEB）中添加15μl连接主混合物（E7645L
，NEB），将条形码连接到原位消化的染色质 ，然后在30°C和20°C下孵育15分钟。通过添加300 mM NaCl终浓度
，每种连接反应被灭活 。将来自不同样品的条形码核合并在一起，并以5,000g的含量固定10分钟
。将核重悬于剪切缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 8 ，0.1％SDS
，1 mM EDTA，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒） ，并通过超声处理裂解。将核悬浮液转移到Covaris Microtube（520052）中，并在峰值功率105 W
，占空比2％和200个循环/爆发的峰值功率下进行超声检查 。为了去除碎屑，将染色质溶液在4°C下以20,000克离心10分钟
。根据制造商的说明 ，使用IP-Star平台（Diagodode）和理想的Chip-Seq套件（Diagenode
，C03010020）进行自动芯片。简而言之，将200μl染色质与抗体在4°C孵育10小时 ，然后与蛋白A磁珠（Thermo Fisher Scientific）孵育 。洗涤后
，在65°C下回收DNA，脱蛋白并降低2小时
。使用Minelute PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化DNA ， 使用Nebnext Ultra II库制备套件的组件进行了用户处理和PCR扩增。每个条件测序至少两个独立的重复 。补充表10中提供了抗体列表
。 　　如先前所述的56
，对Hichip（也称为Plac-Seq）进行了轻微的修改。简而言之，在室温下用1％甲醛用1％甲醛固定500万wt和MSL2-KO细胞 ，然后用0.2 m甘氨酸淬火5分钟 。将固定的细胞颗粒重悬于冷裂解缓冲液中（10 mM Tris
，pH 8.0，10 mM NaCl ，用蛋白酶抑制剂）重悬于0.2％的Igepal Ca-630中。根据以下设置，使用Covaris E220系统通过超声处理进行核分离：75峰值功率
，每次爆发200个周期，3％占空比 ，温度为4°C
。使用明亮场显微镜证实了成功的核分离。然后将核重悬于50 µL 0.5％的SDS中
，并在37°C下孵育10分钟 。Permeabilization was quenched by adding a master mix containing 25 µl 10% Triton X-100, 135 µl water, 25 µl 10× CutSmart buffer and 4 µl MboI enzyme (25 U µl−1, New England Biolabs), followed by digestion for 2 h at 37 °C in a thermomixer, with shaking at 800 rpm.生物素填充是通过在DatP，DGTP ，DTTP
，Biotin14-DCTP（Thermo Fisher Scientific）和25 U的Klenow添加10毫米的填充作用，并在25°C下在热蛋白的25°C下孵育1 h ，在600 rpm时摇动
。在室温下以1×T4 DNA连接酶缓冲液（新英格兰Biolabs）
，0.1 mg ML-1 BSA，1％Triton X-100和4,000 U T4 DNA连接酶（新英格兰生物AB）进行接近连接。收集细胞核 ，然后重悬于1 ml染色质剪切缓冲液中（10 mM Tris
，pH 8.0，100 mM NaCl ，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA
，1％Triton X-100，0.5％钠脱氧酸钠 ，蛋白酶抑制剂） 。使用Covaris E220系统进行超声处理染色质剪切
，持续20分钟，以下设置：104峰值功率 ，每次爆发200个周期
，占名为3％
。将样品以10,000克离心10分钟，并收集上清液。通过在剪切染色质中添加5μg抗H3K4me3抗体（iagodode） ，通过添加5μg抗H3K4me3抗体（DIAGONODE）进行芯片 。第二天
， 每样品使用磁体回收40 µL磁性蛋白G大太蛋白，并用染色质剪切缓冲液洗涤两次 ，然后添加到免疫沉淀样品中
，并在寒冷室中旋转3小时
。孵育后，将珠子用染色质剪切缓冲液洗涤3次 ，LICL缓冲液一次（10 mm Tris，pH 8.0
，250 mm licl，1毫米EDTA ，0.5％Igepal Ca-630
，0.1％钠脱氧乙酸钠）和TE Buffer Twice（10 mm Tris，pH 8.0 ，0.0
，0.1 mm Edta）。为了洗脱DNA，将洗涤后的珠子重悬于洗脱缓冲液（10 mM Tris ，pH 8.0
，350 mm NaCl，1％SDS）中 ，用10μgRNaseA和20μg蛋白酶K
，并在37°C下孵育1 h，然后在65°C下孵育 。使用Zymo DNA清洁和浓缩套件纯化DNA
。使用Dynabeads Myone tretpavidin T1珠进行了Biotin下拉 ，并根据制造商的说明（New England Biolabs，E7645）
，使用Nebnext Ulta II DNA图书馆准备Illumina的Nebnext ultra II DNA库预备套件制备库。 　　根据制造商的说明，使用NEBNEXT酶甲基序列试剂盒（E7120S）进行BS-Seq 。简而言之 ，根据制造商的说明
，使用Qiaamp DNA Mini Kit（Qiagen）从WT和MSL2-KO NPC中提取GDNA。随后，使用E220 Covaris系统将50 ng的高质量GDNA剪切120 s ，以获得长度约300 bp的片段
。在末端准备和EM-SEQ衔接子连接后
，将DNA氧化并使用氢氧化钠变性。将库放大了六个PCR循环，并在Illumina Novaseq 6000 Sequencer上用2×100 bp配对的末端读取 。对于女性9SCA和雄性CABL NPC ，每个克隆测序了三个独立的重复
。并且
，对于男性BLCA NPC，每个克隆测序了四个独立的重复。将样品测序为900–12亿读的深度 ，以允许特定于等位基因的分辨率 。 　　使用SnakePipes mRNA-SEQ管道（V.2.1.2）57处理数据
。适配器和低质量基础（ 0.5) were selected for further analysis. Allele-specific differentially regulated genes were further filtered by standard q < 0.01 or P value of either allele of <0.01 (allele 1, P < 0.01; or allele 2, P < 0.01). Genes that passed allele-specific differential expression analysis (AS P < 0.05 and abs(log2[FC]) > 0.5) were considered to be candidates for the monoallelic categories. The qualifications for different categories were as follows: bi-to-monoA2 genes (WT allele 2/allele 1 log2[FC] >-1和WT等位基因1/（等位基因1+等位基因2）> 0.1;和等位基因1
，log2 [fc]< 0), bi-to-monoA1 genes (WT allele 2/allele 1 log2[FC] < 1; and WT allele 2/(allele 1 + allele 2) > 0.1; and allele 2 log2[FC] < 0), monoA2-to-none (WT allele 2/allele 1 log2[FC] > 1 and allele 2 log2[FC] < 0) and monoA1-to-none (WT allele 2/allele 1 log2[FC] < −1; and allele 1 log2[FC] < 0). Genes were passed into the bi-to-bi-down category if they were differentially expressed in a non-allelic manner and failed to be classified into the above four monoallelic categories. 　　The union of bi-to-mono genes (bi-to-monoA1 and bi-to-monoA2) identified in all four NPCs (Fig. 1d) resulted in a total of 512 genes. Using these genes, we conducted k-means clustering (cluster = 14) of the allele-specific log2[FC] matrix. The log2[FC] (Msl2 KO/WT) of allele 2 was compared to the log2[FC] (Msl2 KO/WT) of allele 1 from allele-specific differential expression analysis using stats (v.4.1.3). 　　We compiled and curated a collection of haploinsufficient genes using data from various sources. This included haploinsufficient genes obtained from ClinGen45, predicted haploinsufficient genes extracted from the GnomAD database (https://www.nature.com/immersive/d42859-020-00002-x/index.html), the DECIPHER database65,66 and a previous study3 in humans (Supplementary Table 3). We then converted these human genes into their corresponding mouse orthologues. We next compared this curated list of haploinsufficient genes with a control group comprising all genes in the mouse genome. Moreover, we compared them to genes that exhibited bi-to-mono changes in NPCs (Fig. 2a (pink genes)). Haploinsufficiency scores were obtained from a previous study3, the GnomAD (https://www.nature.com/immersive/d42859-020-00002-x/index.html), ExAC67 and DECIPHER databases65,66. Higher scores, such as 0.9–1, indicated a gene that is more likely to exhibit haploinsufficiency features, whereas lower scores, such as 0–0.1, suggested that a gene is less likely to exhibit haploinsufficiency. Furthermore, we collected a list of triplosensitivity genes from a previous study3. For visualization purposes, the value 1 was assigned to represent triplosensitivity genes, while the value 0 indicated genes that do not exhibit triplosensitivity. 　　The loss-of-function tolerance metric ‘oe_lof’ represents the ratio of observed over expected predicted loss-of-function variants in a transcript. ‘pNull’ represents the probability that the transcript belongs to the distribution of unconstrained genes. Both scores were obtained from the ExAC database67 and the GnomAD database (https://www.nature.com/immersive/d42859-020-00002-x/index.html). Higher scores, such as 0.9–1, indicate that a gene is more likely to tolerate loss-of-function mutations, whereas lower scores, such as 0–0.1, suggest that a gene is less likely to tolerate such mutations. To facilitate visualization, we calculated the loss-of-function intolerance score by subtracting either the ‘oe_lof’ or ‘pNull’ score from 1. 　　Taking male BlCa and CaBl NPC clones as an example, we compiled genes displaying consistent bi-to-mono changes in CaBl and BlCa (Fig. 2a). Furthermore, we performed k-means clustering of the log2[FC] (KO/WT) matrix of both alleles from reciprocal male clones using stats (v.4.1.3). All of the genes fell into two categories. (1) Same allele change: expression was always lost from the same allele in both clones, either allele 1 (BL6) or allele 2 (CAST). (2) Reverse allele change: the expression was not always lost on the same allele in both clones. 　　For the identification of X-chromosomal escape genes both female 9sCa and CaBl clones were used. From all of the X-linked bi-to-mono genes identified in female 9sCa and CaBl NPCs, we further selected X-linked genes if they passed the criteria for escape genes. Escape genes in female NPCs were identified with the criteria: inactivated X allele normalized counts > 10 and 0.1 < (WT inactivated X allele)/(allele 1 + allele 2) < 0.9. In female 9sCa, n = 131 escape genes were identified; and, in CaBl NPCs, n = 106 escape genes were identified. At a threshold of log2[FC] < −2, 19 and 3 escape genes are downregulated on the X-inactive allele after MSL2 loss in female 9sCa and CaBl, respectively. The complete list of escape genes identified in this is provided in Supplementary Table 7. 　　The data were processed through the snakePipes mRNA-seq pipeline (modified version of v.2.1.2)57, similar to RNA-seq analysis. Adapters and low-quality bases (0.1 in at least one sample that occurred in both WT and Msl2 KO were validated as high-confidence hits and used for further analyses. 　　We also used Cicero (v.1.3.4.7)75 in each NPC clone at the allele-specific level to identify allelic promoter–enhancer connections. The contacts were further filtered using a co-accessibility score of >0.005，如果它们没有与大量分析中的高信心打击重叠 ，则将被排除在外。 　　使用Signac（v.1.5.0）72 Chromvar（v.1.12.0）77的包装器77，计算了Jaspar 2018 Database76的452个转录因子的SCATAC-SEQ转录因子基序富集 。首先计算了基序的可访问性矩阵
，描述了所有细胞中包含每个转录因子基序的峰值
。然后，Chromvar使用此基序可访问性矩阵来计算每个基序的偏差z得分 ，通过将包含基序的峰数与背景集中的预期片段数进行比较
，该峰值构成了混淆技术因素，例如GC含量偏置 ，PCR扩增和可变TN5标记。然后
，使用Signac（V.1.5.0）72 FindMotifs函数对启动子 - 增强剂触点的所有增强子接触的所有增强峰进行了元素富集分析 。所有富集的主题（P< 0.05) were ranked according to −log10[P], and the top 20 enriched motifs from each NPC clone were selected and merged together for plotting. 　　The data were processed using the snakePipes DNA-mapping and ChIP–seq pipelines (modified version of v.2.1.2)57. The DNA-mapping part was the same as for the ATAC–seq analysis (see above). Adapters and low-quality bases ( 1) were overlapped with CpG loci that have an allele-biased methylation frequency (absolute(allele 2 − allele 1) >25％）
。重叠的位点用于生成CG-MOTIF因子结合的小提琴图，而CpG甲基化分离为等位基因1偏见和等位基因-2偏置基因。 　　为了识别具有不等拷贝数的染色体 ，我们使用BS-SEQ数据计算了染色体覆盖量为百万（CPM）
，因为BS-SEQ读取涵盖了大多数基因组区域 。从理论上讲，如果每个等位基因的拷贝数相同 ，则等位基因1和等位基因2的CPM值应相等。如果不是这种情况
，一个等位基因比另一个等位基因显示更多的覆盖范围，则表明发生了染色体拷贝数差异
。两个等位基因上CPM值的倍数变化（等位基因2 CPM/等位基因1 CPM< 0.8 or allele 2 CPM/allele 1 CPM >1.2）用于评估染色体覆盖率的异常值。 　　对于没有BS-Seq数据的克隆 ，我们使用RNA-Seq进行了等位基因2/等位基因1差分表达分析，以识别等位基因偏置的基因 。如果每个等位基因的拷贝数相同
，则等位基因-1偏置基因和等位基因-2偏置基因的数量应相等
。否则，一个等位基因将显示出比另一个等位基因更多的偏见基因。在两个等位基因上的差异表达基因（de Gene）数的Log2转换的倍数变化（log2 [等位基因2 de Gene Number/等位基因1 de Gene数]< −1 or log2[allele 2 DE gene number/allele 1 DE gene number] >1）用于评估异常值 。 　　使用DESEQ2（V.1.26.0）63生成RNA-Seq数据的归一化计数 ，并用于WT和MSL2-KO样品之间的基因表达比较
。The MAplots, box plots, violin plots and donut plots were produced using ggplot2 (v.3.3.2; https://ggplot2.tidyverse.org) and heat maps of gene expression changes were produced using pheatmap (v.1.0.12; https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)在R（v.4.0.3）中。 　　使用Wiggletools平均功能（v.1.2.2）89合并了重复的大wig文件 。使用DeepTools PlotProfile和PlotheatMap（v.3.3.2）62生成了ATAC – SEQ
，CHIP-SEQ和BS-SEQ的METAGENE曲线和热图
。使用PygenoMetracks（V.3.5.1）90产生代表性轨道。使用DeepTools PlotheatMap（v.3.3.2）62通过K-均值聚类将热图中的簇分开 。 　　所有统计分析均使用GraphPad Prism（V.9.1.2）或R（V 4.0.3）进行
。根据现场的接受实践选择样本大小，重复数量 ，克隆数
，错误条和统计测试，并在每个图中陈述。通常 ，实验是独立进行的
，并使用至少三个独立重复进行了复制 。图中的例外是图例和方法部分。统计分析的其他信息和测试结果在图面板或图传奇中指示
。盒子图显示了使用以下组件显示数据的分布：下晶须显示最小的观察值大于或等于较低的铰链-1.5×四分位间范围（IQR）；下铰链显示25％的分位数；缺口的下边缘显示中位-1.58×IQR/SQRT（N）;中心线显示中位数为50％分位数；缺口的上边缘显示了中值+1.58×iqr/sqrt（n）;上铰链显示75％的分位数；上晶须显示最大的观察值小于或等于上铰链+1.5×IQR。