BNT162B疫苗保护恒河猕猴免受SARS-COV-2-2

　　没有使用统计方法来预先确定样本量
。实验不是随机的，除了非人类灵长类动物的血清学测定和基于RT-PCR的病毒载荷测量以及X光片 ，计算机层析成像扫描和组织病理学标本的插管外
，研究人员在实验和结果评估过程中均未对分配视而不见。 　　所有小鼠研究均在Biontech SE进行，协议均由地方当局（地方福利委员会）批准 ，并根据欧洲实验室动物科学协会联合会的建议进行 。研究执行和住房符合《德国动物福利法》和指令2010/63/eu
。将小鼠保存在单独的通风笼中
，具有12小时的光/黑暗周期，受控的环境条件（22±2°C ，45％至65％的相对湿度）和在没有特定的无病因条件下。随意提供食物和水 。仅选择具有无异性健康状况的小鼠进行测试程序
。 　　非人类灵长类动物研究的免疫接种是在路易斯安那大学的拉斐特 - 纽约市伊比利亚研究中心（NIRC）进行的
，该研究中心是由实验室动物护理评估和认证协会（AAAALAC）（动物保证号000452号）认可的。这项工作符合美国农业动物福利法和法规以及涉及重组DNA分子的研究指南，以及微生物和生物医学实验室中的生物安全 。这些猕猴执行的所有程序均符合法规和确定的准则 ，并由机构动物护理和使用委员会或通过道德审查程序进行审查和批准
。免疫接种后
，非人类灵长类动物的挑战在德克萨斯州生物医学研究所（SAN ANTONIO）的西南国家灵长类动物研究中心（SNPRC）进行了免疫接种后，该研究中心也得到了AAAALAC（动物保证号号码000246）的认可。畜牧业遵循AAAALAC国际推荐的标准和《 NIH使用实验动物的使用指南》 。这项研究得到了德克萨斯生物医学研究所动物护理和使用委员会的批准
。 　　将纯化的重组SARS-COV-2 RBD（SINO生物学）或三聚体S（Acro Biosystems）用作Western印迹的靶标 ，并且使用ELISA中使用人类FC（SINO Biological）标记的RBD来检测SARS-COV-2 SARS-COV-2 S-2 S特异性IgG。含有C末端AVITAG（ACRO生物系统）的重组SARS-COV-2 RBD用作Luminex免疫测定中的靶抗原 。在ELISA中使用了纯化的重组SARS-COV-2 S1（包括组氨酸标签）（SINO生物学），以检测小鼠中的SARS-COV-2 S特异性IgG。纯化的重组SARS-COV-2 S1和带有组氨酸标签的RBD（均为SINO生物学）用于表面等离子体共振光谱
。通过11个氨基酸重叠的15-Mer肽的肽池在ELISPOT
，细胞因子分析和细胞内细胞因子染色中重新刺激，然后进行流式细胞仪。无关肽（SpsyvyHQF ，源自GP70 AH-139）或巨细胞病毒（CMV）肽池作为ELISPOT分析的控制 。所有肽均从JPT肽技术获得
。 　　先前描述的1,2,3 SARS-COV-2-CONVALESCENT人血清被用作非人类灵长类动物学的基准。血清（n = 38）是从18-83岁的供体中汲取的
，至少是在PCR确认诊断后的14天以及参与者无症状的时候 。大多数血清供体都有门诊（35/38）或住院（1/38）COVID-19；38个中有2个无症状SARS-COV-2感染
。血清是从乐观的生物科学，MT组和辉瑞职业健康与健康中获得的。 　　HEK293T和VERO 76细胞（均来自ATCC）在Dulbecco改良的Eagle的培养基（DMEM）中培养 ，并补充了10％的胎儿牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich） 。在收到后
，在膨胀和冷冻保存之前，对细胞系进行了支原体污染
。对于包括非人类灵长类动物样品在内的研究 ，将Vero 76和Vero CCL81细胞（均来自ATCC）在含有2％Hyclone胎牛的DMEM（Gibco）中培养
，以及100 U ML -1 Penicillium – Penicillium-链霉素（Gibco）。Expi293F细胞在Expi293培养基中生长，并使用Expifectamine293（全部来自Thermo Fisher Scientific）瞬时转染 。 　　由BNT162B疫苗候选物编码的抗原在SARS-COV-2分离株Wuhan-Hu-1（GenBank MN908947.3）的S序列的背景下设计
。BNT162B1 RNA的DNA模板是编码SARS-COV-2 S信号肽（SP）（氨基酸1-16）的DNA片段 ，SARS-COV-2 S RBD和T4噬菌体纤维纤维纤维蛋白三聚酯化基序（Foldon）。BNT162B2 RNA的模板是用K986P和V987P取代的SARS-COV-2 S的DNA片段 。将BNT162B1和BNT162B2 DNA模板克隆到具有骨架序列元件（T7启动子
，5'和3'UTR，100核苷酸poly（a）尾巴）的质粒载体中 ，由接头（A30LA70，10核苷酸）中断核苷酸poly（a）尾巴
，以提高RNA稳定性和翻译效率。在存在三核苷酸CAP1类似物（（（M27,3'-O）GPPP（M2’-O）APG（M27,3'-O）APG）的情况下，T7 RNA聚合酶对DNA进行了纯化 ，分光光度计的定量和体外转录
。尿苷-5'-三磷酸（UTP）41。使用磁颗粒纯化RNA42 。通过微流体毛细血管电泳（Agilent碎片分析仪）评估RNA完整性
，并确定溶液的浓度，pH ，渗透压
，内毒素水平和生物毒素水平
。 　　使用可离子阳离子脂质的乙醇脂质混合物将纯化的RNA配合到脂质纳米颗粒中，并通过透明地转移到水缓冲液系统中 ，以产生类似于先前描述的脂质纳米颗粒组成。The lipid nanoparticle contains RNA, an ionizable lipid, ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)), a PEGylated lipid, 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide and two structural脂质（1,2-二甲酰基-SN-甘油-3-磷脂（DSPC））和胆固醇） 。候选疫苗候选物的浓度为0.5 mg ml -1
，在-70至-80°C下储存
。 　　将HEK293T细胞用1μg核糖转染试剂混合BNT162B1 RNA或BNT162B2 RNA或候选疫苗Bnt162b1（lipid-Nananoparticle bnt162b1 rna）或BNT162B1 RNA或BNT162B162B162B162B162B162BART162BARTICTICL2BB1（孵育18小时。在Opti-Mem培养基（Thermo Fisher Scientific）中稀释非脂质 - 纳米颗粒成型的mRNA，并根据制造商的说明（Ribojuice ，Merck Millipore）与转染试剂混合 。 　　收集了培养的HEK293T细胞中的培养基
。通过vivaspin 20离心浓度的13倍浓度后
，分子量切出10 kDa的分子量，将上清液施加到制备的Hiload 16/600 Superdex 200 PG柱（均为Sigma Aldrich）上。该色谱柱在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以29.8 cm的H-1运行 ，并收集了500μl的级分（补充图1） 。用在第二次运行中相同条件下分离的明确定义的蛋白质标准品对凝胶过滤柱进行校准
。通过贬低（95°C）（95°C）和非饱和（无加热）页面，使用4–15％标准TGX染色剂（Bio-Rad）和Western Blot分析了BNT162B1-RNA转染HEK293T细胞的尺寸无FBS培养基。使用半齐转移系统（Trans-blot Turbo转移系统
，Bio-Rad）进行转移至硝酸纤维素膜（Bio-Rad） 。用单克隆抗体检测到印迹蛋白，该抗体识别SARS-COV-2 S1（Sinobiological）和次级抗兔马萝卜过氧化物酶（HRP）偶联抗体（Sigma Aldrich）。用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）开发印迹 ，并使用Image Lab Software 6.0版使用FX FX Imager（Vilber）成像
。 　　将转染的HEK293T细胞用可固定的生存力染料（EBIOSCIENCE）染色。固定后（固定缓冲液
，生物产生）后，将细胞透化（PERM缓冲液 ，Ebioscience）
，并用识别SARS-COV-2 S1（Sinobiological）的单克隆抗体染色 。使用BD FACSDIVA软件版本8.0.1在FACSCANTO II流式细胞仪（BD Biosciences）上获取细胞，并通过FlowJo软件版本10.6.2（Flowjo ，BD Biosciences）进行分析
。 　　将转染的HEK293T细胞固定在4％多聚甲醛（PFA）中
，并在PBS/0.2％Triton X-100中透化。自由结合位点被阻断，并与兔单克隆抗体孵育 ，该抗体识别SARS-COV-2 S1亚基（Sinobiologicy）
，一种抗兔IgG二级抗体（Jackson Immunoresearch），标记为凝集素HPA（Thermo Fisher Scientific）和姜黄素科学科学） 。DNA用Hoechst（Life Technologies）染色
。使用Leica SP8共聚焦显微镜和应用套件LAS-X版本3.1.5获取图像。 　　为了表达由BNT162B1编码的ACE2结合分析和冷冻EM编码的RBD – Foldon ，将与RNA编码序列相对应的DNA克隆到PMCG1309载体中 。在EXPI293F细胞中，生成了具有C端HIS-10和AVI标签的人ACE2氨基酸1-615的质粒
。ACE2 – B0AT1复合物是通过在expi293f细胞中共表达的两个质粒
，其中一个编码ACE2氨基酸1-17，然后是血凝集素和链球菌II标签和ACE2氨基酸 ，以及18-805的ACE2氨基酸
，另一种包含甲氨基蛋白的标志和氨基酸标签和氨基酸2-634343434.634;使用镍Excel树脂（GE Healthcare）从条件细胞培养基中分离出分泌的ACE2 PD，然后在PBS中的SuperDex200 10/30列（GE Healthcare）上进行凝胶过滤色谱法。使用Aminolink Plus Resin（Thermo Fisher Scientific） ，通过胺偶联（Thermo Fisher Scientific）
，将约5 mg纯化的ACE2 PD每1 ml每1 ml 4％串珠琼脂糖共价连接 。 　　通过与ACE2 PD交联的琼脂糖亲和力捕获从条件培养基中纯化RBD夹子，并用3 m mgCl2从树脂中洗脱
。透析后 ，使用SuperDex200 10/300色谱柱在4-（2-羟基乙基）-1-吡喃吡嗪甲磺酸（HEPES） - 甘油醇（HBS）中使用SuperDex200 10/300色谱柱浓缩并通过凝胶过滤纯化10％。ACE2 -B0AT1复合物的纯化基于先前描述的程序8 。To form the ACE2–B0AT1–RBD-trimer complex, ACE2–B0AT1 aliquots were combined with purified RBD–foldon diluted in size-exclusion chromatography buffer (25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% glyco diosgenin) for a 3:1 molar ratio of RBD trimers to ACE2 protomers.在4°C孵育30分钟后
，将样品浓缩并在超级糖6增加10/300 GL柱上分离。汇集并浓缩含有复合物的峰分数
。 　　表达由BNT162B2编码的SARS-COV-2 S（P2），以通过尺寸排斥色谱 ，ACE2-PD结合
，单克隆抗体结合和冷冻EM的表征，该基因编码SARS-COV-2（GenBank MN908947）的全长度 ，具有两个蜂蜜和987（k987）和987（knen908947）紧随其后的是C末端HRV3C蛋白酶位点，并将Twinstrep标签克隆到带有CAG启动子的修改后的PCDNA3.1（+）载体中。Twinstrep标记的S（P2）在expi293f细胞中表达 。 　　重组蛋白的纯化基于先前描述的程序
，并进行了较小的修改9
。细胞裂解后，将S（P2）溶解在1％NP-40洗涤剂中。然后将TwinsTREP标记的蛋白在0.5％NP-40中用链霉素Sepharose HP树脂捕获 。如先前报道的9（未显示色谱图） ，S（P2）通过尺寸排列色谱进一步纯化
，并在0.02％NP-40中洗脱为0.02％NP-40的三个不同峰（未显示色谱图）
。结构表征使用了一个由完整的S（P2）组成的峰（P2），以及分解的S1和S2亚基（在75 kDa以上的迁移）组成。S1和S2亚基的自发分离发生在整个蛋白质纯化过程中 ，始于去污剂介导的蛋白质提取
，因此S（P2）制剂还包含解离的S1和S2 。 　　纯化的RBD – FOLDON与ACE2 PD和NP-40溶解化的纯化S（P2）与ACE2 PD的结合以及人类中和人中和单克隆抗体B3825通过Biolayer干涉仪在25°C的八十84（Fortébio）上通过Biolayer干涉测量
。在10 mM HEPES pH 7.5
、150 mM NaCl和1 mM EDTA（EDTA）中测量了RBD – Foldon结合（EDTA）。在25 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，1 mM EDTA和0.02％NP-40中测量S（P2）结合 。将AVI标签的人ACE2 PD固定在链霉亲和素涂层的传感器上；将B38抗体固定在蛋白G涂层传感器上
。对于RBD – Foldon浓度序列 ，收集了结合数据的600 s关联和900 s的解离。对于S（P2）浓度序列
，在初始基线平衡为120 s之后，将传感器浸入AVI标记的ACE2 PD或B38单克隆抗体的10μgml-1溶液中300 s ，以使用阈值函数实现1 nm的捕获水平 。然后
，在基线的另外120 s后，收集了结合数据的300 s关联和600 s的解离。 　　使用Octet数据采集软件版本10.0.0.87收集Biolayer干涉测量数据 ，并使用Fortebio数据分析软件版本10.0进行处理
。将数据参考提取，并拟合为1：1结合模型
，R2值的RBD值大于RBD，S为0.95 ，S（P2）。RBD – Foldon的潜在生动影响以及S1与S（P2）的潜在分离可能使实际结合事件比1：1结合模型所代表的更复杂 。因此
，我们报告了使用Octet数据分析软件V.10.0（Fortébio）计算的结合的明显动力学和亲和力（S（P2））或亲和力（RBD – Foldon）
。对于RBD – Foldon，与ACE2 PD相互作用的解离速率（KD）慢于仪器的测量极限 ，并且使用假定的解离速率KD为1×10-6 s -1
，估算了明显的最小结合率（KD）。 　　将4μL中的纯化的RBD – Foldon应用于与FormVar和Umorphous Carbon（TED PELLA）覆盖的发光铜网格（TED PELLA） 。根据制造商的协议，用Nano-W Organotungstate染色（纳米探针）进行阴性染色
。该样品使用在200 kV下运行的FEI TF-20显微镜成像 ，放大倍率为62,000×
，散焦为-2.5μm。显微照片是使用CTFFIND-4.144在Relion中对比对比传递函数（CTF） 。一个小型手动挑选的数据集用于生成2D引用进行自动启动
。在Relion 3.0.645中对所得的粒子集进行了2D分类。 　　使用在超级分辨率模式下以165,000×的超分辨率模式的300 keV运行的泰坦krios进行冷冻EM，在样品水平上放大的像素大小为0.435Å 。 　　使用Pelco Easiglow使用Pelco Easiglow ，将纯化的ACE2-B0AT1-RBD-Trimer络合物在4μl中的6 mg ml-1中施加到4μl中的4μL中的纯化ACE2 – B0AT1-RBD-Trimer络合物
，将4μl中的ACE2 – B0AT1 – RBD-Trimer络合物施加在残留空气中的30 s Ma中的30 s时，在20 ma的残留空气中发光30 s
。使用Vitrobot Mark IV将样品用-3的力将样品印迹5 s ，然后将其浸入液氮冷却的液体乙烷中。总共从单个网格中收集了7,455个显微照片 。在-1.2至-3.4μm的散焦范围内收集数据，总电子剂量为52.06 e-每Å2分数在6-S暴露的情况下分馏为40帧
，以每架1.30 e-每架1.30 e-2。在Warp46中进行了初始运动校正，在此期间 ，将超分辨率数据进行了归纳
，其像素大小为0.87Å
。用CTFFIND-4.144将校正后的显微照片导入3.1-Beta45进行CTF估计。 　　使用Relion实现的高斯颗粒颗粒算法挑选颗粒，并以450像素的盒子尺寸提取 。通过2D分类获得的参考文献用于第二轮基于参考的自动打击 ，得出715,356个颗粒的数据集
。每个粒子的三个RBD中的两个（两个未与ACE2-B0AT1结合约束的RBD）在2D分类中表现出弥散的密度
，这些密度反映了高粒子柔韧性，这与由负孔微观显微镜观察到的RBD三聚体的构象柔韧性一致（图1C ，d）。这种灵活性排除了所有三个RBD在最终结构溶液中的包含 。用2D和3D分类滤出颗粒异质性
，掩模大小为280Å，以滤除每个RBD三聚体中两个非ACE2结合的RBD副本的弥散密度 ，产生了87,487个颗粒
，可通过C2符号符号进行精制至3.73Å
。胶束和B0AT1密度减去颗粒后的细化产生了3.24Å的改进图。蛋白质数据库代码（PDB）的原子模型6M178被刚化成3.24Å密度，然后在phenix47中使用真实空间改进灵活地拟合到密度 ，与COOT48中的手动构建交替 。显微镜使用Serialem软件版本3.8.0 beta49操作用于图像采集
。该模型的验证如图2所示。数据收集，3D重建和模型改进统计量在扩展数据表1中列出 。 　　对于Twinstrep标记的S（P2）
，将4μl纯化的蛋白在0.5 mg ml-1处施加到金量子R1.2/1.3 300网格网格中，与石墨烯氧化石墨烯新鲜覆盖
。使用Vitrobot Mark IV将样品用-2的力将样品印迹4 s ，然后将其浸入液氮冷却的液体乙烷中。我们从2个相同准备的网格中收集了27,701个显微照片 。从每个网格中收集数据
，分别在-1.2至-3.4μm的散焦范围内，总电子剂量分别为50.32和50.12 E-每Å2 ，在6-S暴露中分数为40帧
，为1.26和1.25 e-e-2 E 1.25 e-每架每帧每架1.25 e-25 e-2。在WARP46中进行了450像素的固定运动校正，CTF估计以及颗粒的挑选和提取 ，在此期间
，将超分辨率数据进行了套索，以使像素大小为0.87
。总共提取了1,119,906个颗粒。随后的所有处理均在Relion 3.1-Beta45中进行 。用2D和3D分类过滤粒子异质性 ，产生一组73,393个颗粒
，用C3对称性精制到3.6Å
。该数据集的三维分类没有粒子对齐，将一个类带有一个RBD向上分开 ，代表15,098个粒子。将其余的58,295个颗粒（在三rbd降低构象中）进行了完善，以3.29Å的最终模型给出了最终模型 。来自PDB 6XR89的原子模型刚性化合在地图密度中
，然后使用phenix47中的真实空间改进灵活地拟合到密度中，与COOT48中的手动构建交替
。Cryo-EM模型验证在扩展数据图2中提供 ，完整的Cryo-EM数据处理工作流程以及扩展数据表1中提供的模型完善统计数据。 　　将雌性BALB/C小鼠（Janvier）（8-12周龄）随机分配给组 。BNT162B1和BNT162B2在PBS中稀释300毫米蔗糖（图2A – C
，两个BNT162疫苗候选物的扩展数据图3；图2E，图2E ，BNT162B2的扩展数据图4a）或0.9％NACL（图2D）
，图2D，图2D ，图
。2e
，扩展的数据图4a的BNT162B1）在异氟烷麻醉下以20μL的体积注入腹腔肌肉。具有300 mM蔗糖或0.9％NaCl的PBS分别用作缓冲液对照 。 　　雄性猕猴（2-4岁）随机分配为在第0天和第21天和21天接受BNT162B1或BNT162B2或在第0天和21或35的盐水控制中接收BNT162B2
。通过左四头肌肌肉中的肌内注射在0.5 mL中施用疫苗。免疫过程中用氯胺酮HCl（10 mg kg -1;肌肉内）麻醉猕猴，并监测是否有足够的镇静剂 。 　　从异氟烷麻醉或没有麻醉的腔静脉面部下 ，从轨道静脉丛中收集外周血。对于流式细胞仪
，血液被脱墨
。对于血清产生，将血液在16,000g下离心5分钟 ，并立即将血清用于下游测定或储存在-20°C下。通过将组织与70μm细胞过滤器（BD Falcon）的表面捣碎，在PBS中制备脾脏单细胞悬浮液 。通过低渗裂解去除红细胞
。将popliteal
，腹股沟和i的淋巴结淋巴结合并，切成碎片 ，用胶原酶D（1 mg ML -1）（Roche）消化
，并通过细胞过滤器。 　　在注射BNT162B1，BNT162B2或盐水后 ，在1 、14
、21、28 、35和42天之前
，在1
、14、21 、28
、35和42天之前获得血清（扩展数据表2） 。对于BNT162B2和挑战队列3对照，在第56天还获得了血清 ，并在免疫之前和第7、28和42天获得了外周血单核细胞（PBMC）（PBMC）（除了从第28天的挑战队列3对照Macaques获得的PBMC（除外）
。血清和PBMC的血液是根据NIRC机构动物护理和使用委员会批准的2017-8725-023的动物协议收集的。在血液收集过程中
，用氯胺酮HCl（10 mg kg -1;肌肉内）麻醉猕猴，并监测是否有足够的镇静剂 。 　　在碳酸钠缓冲液中 ，用重组S1或RBD（1μgml-1）涂覆了Maxisorp板（Thermo Fisher Scientific）
，并使用HRP偶联的二级抗体和四甲基苯甲酰苯二氮二氮基酸酯（生物趋势）检测到了血清衍生的IgG
。使用BioTek Epoch读取器和Gen5软件版本3.0.9进行数据收集。为了浓度分析，在串行稀释中并联使用IgG小鼠同种型对照 ，并将样品信号与同种型对照的标准曲线相关 。 　　重组SARS-COV-2 S1含有C末端AVITAG（ACRO BIOSYSTEMS）与链霉亲和素涂层的Luminex微球结合
。用荧光标记的山羊抗人类多克隆二抗（Jackson Immunoresearch）检测到血清中存在的结合猕猴或人类抗S1抗体。Data were captured as median fluorescent intensities using a Bioplex200 system (Bio-Rad) and converted to U ml−1 antibody concentrations using a reference standard consisting of 5 pooled SARS-CoV-2-convalescent human serum samples (obtained >14 days after PCR diagnosis, from the panel described in ‘Panel of SARS-CoV-2-convalescent human sera’), diluted in antibody-depleted human任意分配浓度为100 U mL -1的血清，并考虑血清稀释系数 。 　　使用BIACORE T200设备（Cytiva）确定小鼠S1和RBD特异性血清IgG与重组S1和RBD的结合动力学
，该动力学具有10 mM HEPES，150 mM NaCl ，3 mM EDTA
，3 mM EDTA，0.05％V/V/V/V表面上的P20（HBS-EP-EP-EP Running Bufferer ，br100669）
，Cy.100 cyer，Cy.0.05％v/v表面上。用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二二酰二酰羟基氯化物和N-羟基糖酰亚胺的混合物激活CM5传感器芯片基质上的羧基 ，以形成活性酯
，以与胺基反应
。将抗小鼠IgG FC抗体（Jackson Immunoresearch）稀释在10 mM乙酸钠缓冲液pH 5（30μgml-1）中，以共价耦合至约10,000个响应单位的固定水平。用乙醇胺将传感器表面上的游离N-羟糖酰亚胺酯在传感器表面停用 。 　　将小鼠血清在HBS-EP缓冲液中1:50稀释 ，并在10μlmin-1中施加30 s
，以通过固定抗体捕获活性流量细胞，并用缓冲液处理参考流动池
。使用多环形动力学方法进行捕获的小鼠IgG抗体对S1 – HIS或RBD -HIS（SINO生物学）的结合分析 ，其浓度分别为25至400 nm或1.56至50 nm。缔合周期为180 s之后的分离周期为600 s，恒定流速为40μlmin -1和最终再生步骤 。使用全局动力学拟合模型计算捕获的多克隆IgG的明显结合动力学（1：1 Langmuir
，Biacore T200评估软件3.1版，Cytiva）
。 　　用SARS-COV-2 s对编码绿色荧光蛋白（GFP）而不是VSV-G（VSV（ΔG-GFP））编码绿色荧光蛋白（GFP）的重组复制VSV载体进行了使用SARS-COV-2 s进行了型型。简而言之 ，转染的HEK293T/17单层转染了C-末端细胞质19氨基酸（SARS-COV-2-S（CΔ19））截断的SARS-COV-2 S
，用VSVΔGG-GFP载体（从PVSVΔGGFP-GFP PlastId Camperfast）接了VSVΔG-GFP载体；在37°C下孵育1小时后，除去接种物 ，然后将细胞用PBS洗涤
，然后在培养基中补充抗VSV-G抗体（克隆8G5F11，kerafast） ，以中和以中和残留的输入病毒 。接种后20小时收集含VSV-SARS-COV-2伪病毒的培养基
，进行0.2μm滤过，并在-80°C下储存
。 　　将Vero-76细胞接种在96孔板中。制备小鼠血清样品的系列稀释液 ，并在室温下与VSV-SARS-COV-2假病毒悬浮液（每毫升4.8×103个传染性单元）预孵育10分钟
，然后再将混合物转移到VERO-76细胞中 。将接种的VERO-76细胞在37°C下孵育20小时
。将板放入incucyte Live细胞分析系统（Sartorius）中，并在分析之前孵育30分钟（Incucyte 2019b Rev2软件）。使用4倍物镜对明亮场和GFP荧光进行全孔扫描 。据报道 ，与无伪病毒阳性对照的平均值相比，PVNT50是血清最高稀释的血清的倒数。每个血清样品稀释均以一式两份测试
。 　　根据制造商的说明（MABTECH）
，使用小鼠IFNγELISPOTPLUS试剂盒进行ELISPOT测定。总共用全长S肽混合（0.1μgml-1每肽的最终浓度）或对照组（GP70-AH1（SpsyvyHQF）39，4μgml-1; concanavalin a ，2μgml-1（SIGIGMMAMMA）） 。加入链霉亲和素 - 碱性磷酸酶和5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸盐/硝基蓝蓝蓝色四唑 - 甲基底物
，并使用ELISPOT板读取器（Immunospot S6 Core Analyzer（CTL））对斑点进行计数
。使用免疫接收图像采集软件V.7.0和Immunospot 7.0.17.0专业人士评估了斑点。该软件计数的斑点数量太多了，将软件计数设置为1,500 。对于T细胞的亚型 ，根据制造商的说明
，使用MAC（CD8A（LY-2）和CD4（L3T4）（L3T4）（Miltenyi Biotec））从脾细胞悬浮液中分离CD8+ T细胞和CD4+ T细胞
。随后，用5×104的同型骨骼衍生的树突质细胞（含有全长S肽混合物（0.1μgml-1 finter limations）或蜂窝培养基作为对照 ，将CD8+或CD4+ T细胞（1×105）（1×105）重新刺激。通过流式细胞仪确定分离的T细胞子集的纯度
，以计算每1×105 CD8+或CD4+ T细胞的斑点计数 。 　　用市售的非人类灵长类动物IFNγ和IL-4 ELISPOT测定试剂盒（MABTECH）测试了猕猴PBMC
。用苯酶（EMD Millipore）在预热的AIM-V培养基（Thermo Fisher Scientific）中解冻冷冻保存的猕猴PBMC。对于IFNγELISPOT，将1.0×105 PBMC和对于IL-4 ELISPOT（2.5×105 PBMC）用1μgml-1的全长S重叠肽混合物刺激 。包括在一式三份井中和含有二甲基亚氧化二甲基亚氧化二甲基亚氧化二甲基二甲基二甲基二甲基二甲基肽池和植物凝集素（Sigma）的培养基中进行的测试
。IFNγ24小时后 ，添加了IL-4
，链霉亲和蛋白-HRP和3-氨基-9-乙基碳水化合物底物（BD Bioscience），并使用CTL Immunospot S6通用分析仪（CTL）计数斑点。显示的结果是每106个PBMC减去背景（中型）和标准化为斑点细胞 。 　　为了在周围血液中的T细胞分析中 ，将50μl新鲜抽取血液的红细胞裂解（氯化铵 - 氯化铵 - 硫化物裂解缓冲液（GIBCO）），细胞用可固定的生存能力染料（EBIOSOSCIEICE）染色（EBIOSOSCIEICE）
，在FC中添加了FC培养基（Dulbib）的作用（dilebecco），并用FC blaffere（dulbib）（delle）（delecco）染色（2％胎牛血清（FCS） ，2 mM EDTA（Sigma）和0.01％叠氮化钠（Morphisto））。在流动缓冲液中用继发性生物素偶联抗体染色后
，细胞外染色在表面标记物上，直接标记的抗体和链霉亲和链霉素在辉煌的染色缓冲液加（BD Bioscience）中稀释
。用2％Rotihistofix（Carl Roth） ，固定（FIX/PERM缓冲液
，FOXP3/转录因子染色缓冲液集（EBISOSCIENCE））和通透性（PERM缓冲液，FOPS3/Transcription因子染色缓冲套件（EBIOSCIENCE））洗涤细胞。透化细胞在细胞内用FC块处理 ，并用抗体抗体染色
，以抗转录因子在PERM缓冲液中 。 　　为了在淋巴组织中进行T细胞分析，将1×106个淋巴结细胞（对于BNT162B1）或1.5×106个淋巴结细胞（对于BNT162B2）和4×106个脾细胞被染色 ，以使用直接标记的抗体
，以使其生存能力和细胞外抗原
。如描述的血液T细胞染色所述进行固定，通透性和细胞内染色。 　　对于淋巴组织中的B细胞亚型 ，用FC块处理2.5×105个淋巴结和1×106个脾细胞，染色以生存能力和细胞外T细胞染色
，并用2％Rotihistofix固定过夜 。 　　对于来自BNT162B1免疫的小鼠的T细胞的细胞内细胞因子染色，将1×106个淋巴结和4×106个脾细胞用全长S肽混合物的每个肽的每肽的0.2μgml-1终浓度恢复
。对于使用BNT162B2免疫的小鼠的T细胞的细胞内细胞因子染色 ，将4×106个脾细胞与全长S肽混合物或细胞培养基（无肽）的每肽的0.5μgml-1终浓度一起恢复为4×106个脾细胞。在Golgistop和Golgiplug（均为BD Bioscience）存在的情况下
，将细胞重新刺激5小时5小时 。如淋巴样T细胞染色所述，对细胞的生存力和细胞外抗原进行染色
。用2％的rotihistofix固定细胞 ，并透化过夜。如描述的血液T细胞染色所述进行细胞内染色 。 　　使用BD FACSDIVA软件版本9.1或8.0.1.1
，在BD交响曲A3或BD CELESTA（B细胞亚型）流式细胞仪（BD Bioscience）上获取小鼠细胞，并与FlowJo 10.6（FlowJo ，BD
，BD Bioscisences）进行分析
。 　　对于T细胞中细胞内细胞因子染色，以1μgml-1（所有肽的浓度 ，合并的浓度）
，葡萄球菌肠毒素B（2μgml-1）作为阳性对照，或0.2％DMS​​O对照对照 ，用全长S肽混合刺激1.5×106 PBMC。添加了高尔基托普和高尔基波格（两个BD生物科学） 。在37-°C孵育12至16小时后，将细胞染色以使其生存力和细胞外抗原在阻断了直接标记的抗体的FC结合位点后。固定细胞
，用BDCytofix/thoperm溶液（BD生物科学）透化，并在室温下在透化缓冲液中进行30分钟的细胞内染色
。洗涤细胞 ，重悬于2％FBS/PBS缓冲液中
，并在LSR Fortessa上获得。通过FlowJO 10.4.1（FlowJo，BD Biosciences）分析数据 。显示的结果是减去背景（媒体– DMSO）
。 　　将小鼠脾细胞与全长S肽混合（每肽的0.1μgml-1终浓度）或细胞培养基（无肽）作为对照重新刺激48小时。IFNγ ，IL-2
，IL-4，IL-5和（对于上清液中BNT162B2免疫小鼠的脾细胞）IL-13的浓度使用基于珠子的11-PLEX TH1/TH2小鼠Procartaplex Procartaplex procartaplex procartaplex多重IMPLEX IMPLEX ImmunoAseAsay（Thermo Fisher Fisher Scientific）根据制造商的说明来确定上清液中的IL-13 。用Bioplex200系统（Bio-RAD）测量荧光 ，并用Procartaplex Analyst 1.0软件（Thermo Fisher Scientific）进行分析
。低于下限的量化值设置为零。 　　SARS-COV-2中和测定法使用了先前描述的SARS-COV-2（USA_WA1/2020）的菌株
，该菌株是通过反向遗传学挽救的，并通过将Mneongreen基因插入Viral Genome27的开放阅读框7中进行了设计 。该记者病毒与野生型病毒产生类似的斑块形态和无法区分的生长曲线
。如前所述52 ，病毒主库存在VERO E6细胞中生长。在测试人疗养血清标本时
，荧光中和测定结果可与常规斑块还原中和分析产生可比的结果 。Serial dilutions of heat-inactivated sera were incubated with the reporter virus (2 × 104 plaque forming units (PFU) per well) to yield an approximately 10–30% infection rate of the Vero CCL81 monolayer for 1 h at 37 °C before inoculating Vero CCL81 cell monolayers (targeted to have 8,000 to 15,000 cells in the central field of each well at the time of seeding,感染前一天）在96孔板中，可以准确地定量感染细胞
。通过核染色（HOECHST 33342）列举细胞计数 ，并在接种7细胞成像多模式读取器（Biotek）的Gen5 Image Prime Prime 3.09后，检测到荧光病毒感染的焦点。通过在每个连续血清稀释下产生中和的4参数后勤拟合
，在GraphPad Prism版本8.4.2中计算滴度 。据报道，VNT50是稀释的插值倒数 ，荧光病毒灶降低了50％。 　　SARS-COV-2接种物是从先前在德克萨斯州生物医学研究所制备的2.1×106 PFU ML-1的股票获得的
，将其等分为单使用的瓶并存储在-70°C下
。工作病毒量是由SARS-COV-2 USA-WA1/2020分离株的两个通道产生的（第四通道种子库存是从BEI资源购买的，NR-52281）在Vero E6细胞中。通过对已发表的SARS-COV-2序列（GenBank登录号MN985325.1）证明身份的深度测序 ，证实该病毒为SARS-COV-2 。 　　BNT162b1-immunized (n = 6) and BNT162b2-immunized (n = 6) male macaques, and age-matched male macaques mock-immunized with saline (n = 9) (control), were challenged with 1.05 × 106 PFU of SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 isolate, split equally between the intranasal (0.25 ml) and如前所述28
，气管内（0.25 mL）途径
。对哨兵年龄和性别匹配的猕猴（n = 6）进行模拟挑战DMEM，并补充了10％FCS内（0.25 mL）和气管内（0.25 mL）。相对于扩展数据中指示的免疫接种 ，猕猴受到了挑战或模拟挑战
，图6，扩展数据表2 。 　　挑战赛前十二至19天 ，猕猴从NIRC移动到SNPRC的动物生物安全3级设施中
。通过董事会认证的兽医定期监测猕猴
，以进行直肠体温，体重和体格检查。如前所述28 ，在Tiletamine Zolazepam（Telazol）麻醉下进行了标本收集 。在扩展数据6，扩展数据表2中所示的时间进行了支气管肺泡灌洗以及鼻腔
，鼻腔和直肠拭子收集，X射线和CT检查以及死灵检查
。通过将20毫升盐水灌输4次进行支气管肺泡灌洗。将这些洗涤物汇总 ，等分并储存在-70°C下 。 　　为了检测和量化非人类灵长类动物中的SARS-COV-2
，从支气管肺泡灌洗液中提取病毒RNA，并从先前描述的53,54,55中从支气管肺泡灌洗液和鼻 ，口咽和直肠拭子中提取
，并如前所述由RT-QPCR测试
。简而言之，将10μg酵母TRNA和1×103 PFU的MS2噬菌体（大肠杆菌MS2）（ATCC）（ATCC）添加到每个解冻样品中 ，并使用NucleMag病原体试剂盒（Macherey-Nagel）进行RNA提取。使用美国疾病控制和预防中心开发的2019-NCOV N1分析
，在QuantStudio 3仪器（Applied Biosystems）上使用2019-NCOV NC N1分析进行SARS-COV-2 RT-QPCR 。阳性（检测极限）的临界值是以10个基因等效物（每个反应为800个基因等效物）建立的。样品被重复测试
。挑战后第6天获得的挑战队列2对照组的一个支气管肺泡灌洗样本，在挑战后的第1天获得了BNT162B1免疫组的一只鼻拭子 ，在LLOD的两侧进行了重复测量。这些标本被归类为不确定的
，并将其排除在图和分析之外 。 　　如前所述28，在麻醉下进行了胸部X光片和计算机断层扫描
。For radiographic imaging, three-view thoracic radiographs (ventrodorsal, right and left lateral) were obtained at the times relative to challenge indicated in Extended Data Table 2. The macaques were anaesthetized using telazol (2–6 mg kg−1) and maintained by inhaled isoflurane delivered through a Hallowell 2002 ventilator anaesthesia system (Hallowell).猕猴被插管以使用远程呼吸呼吸开关执行最终的Insperation呼吸。使用Multiscan LFER150 PET/CT（MEDISO）扫描仪获取肺场计算机断层扫描图像 。使用VivoQuant（Invicro）可用的3D区域工具进行图像分析
。图像是由对治疗组蒙蔽的董事会认证的兽医放射科医生解释的。分数分为每一个地区的严重程度为0-3的总数7-3个肺部区域 ，最大严重程度得分为21 。肺部病变在挑战前明显，或者不能明确地归因于病毒攻击（例如耐肺部的性心ltect骨和麻醉性）
，收到0的得分
。 　　据报道，在扩展数据中指出的挑战后 ，在2-4岁的男性猕猴上进行了肺部组织病理学。将样品固定在10％中性缓冲的福尔马林中
，并定期加工成石蜡块 。将组织块切为5μM，并用降血石和曙红染色
。SNPRC和辉瑞病理学家盲目地进行了每个猕猴的7个肺组织切片（左右肺中的1个样本）的显微镜评估。使用半定量评分系统评估肺部 ，其中包括细胞类型和/或分布 。炎症评分基于涉及的部分组织面积：0 =正常；1≤10％；2 = 11–30％；3 = 30–60％；4 = 60–80％；5≥80％。每个叶都获得了个体得分
，每个猕猴的最终分数被报告为单个分数的平均值
。在诊断同意后，病理学家对小组分配没有盲。如图6所示 ，扩展数据表2
，BNT162B1免疫和对照猕猴在并行（挑战群体1和2）中受到挑战，并且被杀死 ，而BNT162B2-2-immunized猕猴随后被免疫并受到挑战（挑战）（挑战）（挑战赛3） 。 　　没有使用统计方法来确定组和样品尺寸（n）
。所有实验均进行一次。通过非参数分析（Friedman的测试）确定了基于病毒RNA脱离数据的排名
，通过非参数分析（Friedman的测试）确定了用于RT – QPCR分析的P值 。使用SAS 9.4的PROC等级和PROC GLM来计算P值
。在分析中包括所有可用的挑战后支气管支气管肺泡灌洗液以及鼻腔猕猴的鼻腔，口咽和直肠拭子样品 ，以及所有未钉猕猴的所有可用的挑战后样品。不确定的结果被排除在此分析之外 。所有其余分析均进行两尾分析，并使用GraphPad Prism 8.4进行
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。