GTSF1通过PIWI-CLADE ARGONAUTE蛋白加速目标RNA裂解

　　补充数据表1提供了所有使用的所有寡核苷酸的序列。为了创建PSCALPS_PURO_EGFP，将IRES驱动的EGFP插入了多个克隆位点的下游 ，并在慢病毒传输量PSCALPS_PURO的嘌呤霉素编码序列的上游插入 。MIWI cDNA获自哺乳动物基因收集（https://genecollections.nci.nih.gov/mgc/）
。MILI cDNA通过小鼠睾丸总RNA的RT -PCR扩增。Gibson组装和限制克隆用于克隆MILI和MIWI编码序列中的pscalps_puro_egfp
，将它们与N端3×FLAG和快照标签融合 。通过使用HEK293T细胞中的Transit-2020（Mirus Bio）与PSPAX2和PMD2.g（4：3：1）共染料，慢跑病毒的转移载体是通过共转染的
。在16 µg ML-1聚甲烯（Sigma）存在下 ，使用含有慢病毒的上清液将HEK293T细胞转导HEK293T细胞
，以获得稳定的表达Piwi表达细胞系。进行了三个顺序转导，以最大化重组蛋白的产生 。在存在2 µg mL -1紫霉素的情况下选择转导的细胞两周 ，然后通过FACS（UMass医学院流式细胞仪核心）选择表达最高EGFP荧光的5–10％最高EGFP荧光的细胞
。稳定地表达重组PIWI蛋白的选定细胞被扩展
，收集和细胞颗粒闪光，并储存在-80°C下。 　　小鼠GTSF1 cDNA在扭曲生物科学上合成 ，并通过限制克隆克隆到PCOLD-GST（TAKARA BIO）细菌表达载体中 。GTSF1突变体
，GTSF1L和GTSF2-表达PCOLD-GST载体在扭曲生物科学上合成
。先前描述了piz-fag-6×his-siwi63。标记的米利和表达Miwi的载体是Shinpei Kawaoka（日本京都京都大学）的友善礼物 。MMGTSF1 cDNA通过PCR通过小鼠精子干细胞总RNA64的逆转录（RT -PCR）扩增。BMGTSF1和BMGTSF1样cDNA通过BMN4细胞总RNA的RT – PCR扩增
。通过融合克隆（Takara）将放大的cDNA片段和DNA片段编码V5SBP克隆到pcDNA5/frt/到vector（Thermo Fisher Scientific）。Muelleri GTSF1编码序列是从65获得的，并将其克隆到细菌表达载体PSV272（IJM）中 。 　　在Cyagen进行了3×FLAG-HA – HA-TAGSF1小鼠（C57BL6/J-GTSF1EM1（FLAG）PDZ）的产生
。标签的编码顺序由CRISPR – CAS9插入内源性基因座。简而言之 ，将受精的小鼠胚胎注入了针对序列GTCTCTCATGCTGATGGCAAAGG（PAM），3×FLAG-HA-TAG盒HDR供体和Cas9 mRNA的SGRNA 。补充数据表1提供了用于基因分型的HDR供体和寡核苷酸引物的序列
。对创始人F0小鼠进行基因分型并育种
，以产生携带种系传输敲入等位基因的F1小鼠。根据马萨诸塞大学陈医学院（A201900331）的机构动物护理和使用委员会的指南维护和使用小鼠 。C57BL/6J小鼠（RRID：IMSR_JAX：000664）用作野生型对照，并在所示
。动物被安置在具有控制温度（22±2°C） ，相对湿度（40％±15％）的AALAC认可的屏障设施中
，而12小时：12小时深：暗循环。 　　通过离心收集表达表达稳定的细胞，并在-80°C下储存 ，直到将它们裂解为10 ml裂解缓冲液（30 mM Hepes-KOH
，pH 7.5，100 mm乙酸钾 ，乙酸钾
，3.5 mm乙酸镁，乙酸镁3.5 mm ，1 mm dtt
，1 mm dtt，0.1％v/v/v triton x-1％x-1％x-100％x-100％ ，20％x-100，抑制剂鸡尾酒（1毫米4-（2-氨基乙基）苯磺酰基氟化盐酸盐（Sigma
，A8456），0.3μm的折断蛋白 ，40μm甲烷蛋白盐酸盐盐酸盐
，10μm 。E-64（sigma，e3132） ，10μm
，perfate perfate perfate，perfate perfateN
。通过用锥虫蓝色染色来监测细胞裂解。在20,000g（S20）或100,000g（S100）中阐明粗糙的细胞质裂解物30分钟 ，等分
，闪光并储存在-80°C下 。为了捕获PIWI蛋白，将澄清的裂解液与20μl抗FLAG M2丙磁珠（Sigma）每毫升裂解液孵育2小时 ，以在4°C下过夜旋转。用高盐洗缓冲液（30 mm Hepes-KOH
，pH 7.5，2 M乙酸钾 ，3.5 mm乙酸镁，1 mm DTT）洗涤珠五次
，两次含有低盐缓冲液（高盐水缓冲液）（高盐水缓冲液（除含100毫米乙酸钾和0.01％V/V/V/V Triton X-3-100）
。为了组装PIRISC，将珠子重悬于含有100 nm合成指南的低盐缓冲液中 ，并在37°C或室温下旋转30分钟。Miwi Pirisc或未载的Apo Miwi在裂解缓冲液中从珠子中洗脱
，在4°C下，在没有0.1％V/V Triton X-100或蛋白酶抑制剂的情况下 ，在裂解缓冲液中以200ngμl-1 3×FLAG肽洗脱 。将含有piwi pirisc的洗脱液等分并存储在-80°C下
。EFPIWI PIRISC纯化已描述为35。AGO2 SIRISC使用寡核亲和力纯化进行纯化
，如所述66 。 　　将PCOLD-GST GTSF表达载体转化为Rosetta-Gami 2竞选细胞（Novagen）
。在37°C的1μMZnSO4存在下生长细胞，直到OD600〜0.6-0.8 ，然后在冰上冷却30分钟以引发冷休克。用0.5 mM IPTG诱导蛋白质表达在15°C下18小时 。通过离心收集细胞
，用PBS洗涤两次，然后冷冻细胞颗粒并将其存储在-80°C下
。将细胞颗粒重悬于裂解/GST柱缓冲液中 ，其中含有20 mM Tris-HCl pH 7.5、500 mM NaCl
，1 mM DTT，5％V/V甘油和完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒（Roche）。通过高压微流体（微流体M110P）在18,000 psi处的单个通过时通过单个通道裂解细胞 ，并在4°C下以30,000g的含量在30,000g时阐明1 h 。通过0.2 µm低蛋白结合注射器滤波器（Milles Durapore; EMD Millipore）过滤澄清的裂解物，并应用于用GST柱缓冲液平衡的谷胱甘肽Sepharose 4B树脂（Cytiva）
。排干流通后
，将树脂用50列体积GST柱缓冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白质并在单个步骤中裂解GST标签，将50 U HRV3C蛋白酶（Novagen）添加到色谱柱中 ，将色谱柱密封并在4°C下孵育3 h
，然后将其排干以收集裂解的蛋白质 。将蛋白质稀释至50 mM NaCl，并使用HITRAP Q（Cytiva）阴离子交换柱进一步纯化 ，用20 mM Tris-HCl
，pH 7.5 、50 mM NaCl，1 mM DTT和5％V/V Glycerol平衡。使用同一缓冲液中的100-500 mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质
。通过SDS-PAGE分析了峰值分数 ，并将最纯度的纯度汇合
，并将透析液透析为含有30 mM Hepes-KOH的储存缓冲液，pH 7.5 ，100 mm乙酸钾
，乙酸镁3.5 mm，1 mm DTT ，DTT，20％V/V/V glycerol。为了避免在纯化和透析期间
，将GTSF2的降水为7.3，20 mm Tris-HCl ，pH 8.8 。 　　对于扩展数据
，图6A，根据制造商的指示 ，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）将HEK293T细胞用小鼠和昆虫GTSF1编码序列转染到PCDNA5表达载体中
。在36小时后收集细胞
，并在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.4），150 mM NaCl ，1.5 mm MgCl2
，0.15％V/V Triton X-100，100μgml-1 RNase A（QIAGEN） ，0.5 mm DTT
，1×COLLED EDTA-FREE蛋白（ROCHE）中（ROCHE）（ROCHEE）。在17,000克离心20分钟后，在4°C下 ，将额外的NaCl（0.65 m最终浓度）和1％V/V Triton X-100（最终浓度）添加到上清液中，并将裂解物与链霉亲素 - 塞膦糖高性能（cytiva）颗粒在4°C下孵育1小时 。The beads were washed with wash buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1% v/v Triton X-100, 0.5 mM DTT) five times and rinsed with lysis buffer without RNase A. SBP-tagged recombinant proteins were eluted with elution buffer (30 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM potassium乙酸盐
，2 mm乙酸镁，2.5 mm生物素 ，0.5 mm DTT）
。 　　对于图3H
，将EMGTSF1表达载体转化为BL21（DE3）细胞（新英格兰Biolabs）。将转化的细胞在37°C的1μMZnSO4补充的LB中生长，直到OD600〜0.6-0.8 。将孵育温度降低至16°C ，并通过添加1 mM IPTG诱导蛋白质表达4小时
。通过离心收集细胞
，并将细胞颗粒闪烁在液氮中，并在-80°C下储存以供将来使用。将解冻的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris ，pH 8
，300 mm NaCl，0.5 mM TCEP）中 ，并通过高压（18,000 PSI）微晶体（MicroFuidics M110P）诱导蜂窝裂解 。通过在4°C下以30,000克离心20分钟来阐明所得的裂解物
。将澄清的裂解物应用于Ni-NTA树脂（Qiagen）并孵育1小时。将树脂用镍洗手缓冲液（300毫米NaCl
，20 mm咪唑，0.5 mm TCEP ，50 mm Tris，Tris
，pH 8）广泛洗涤 。将蛋白质在四柱体积的镍洗脱缓冲液中洗脱（300毫米NaCl，300 mM咪唑 ，0.5 mM TCEP
，50 mm Tris，Tris ，pH 8）。将TEV蛋白酶添加到洗脱蛋白中
，以诱导N端His6和MBP标签的裂解和去除
。将所得的混合物与HITRAP透析缓冲液（300 mM NaCl，20 mM咪唑 ，0.5 mM TCEP
，50 mM TRIS，pH 8）在4°C下过夜。然后 ，透析蛋白通过5毫升hitrap螯合柱（Cytiva）
，并收集了未结合的材料 。使用超级排斥色谱将未结合的材料浓缩，并使用超级磁性200增加10/300柱（Cytiva）在50 mm Tris ，pH 8，300 mm NaCl和0.5 mm TCEP中平衡
。通过SDS -PAGE分析了峰分数的纯度
，并合并最纯度，浓缩至150 µm ，等分并在-80°C下储存。 　　Approximately 300,000 FACS-purified secondary spermatocytes (Sp2) from wild-type (C57BL/6) or 3×Flag–HA–GTSF1-expressing (Gtsf1Flag/Flag) mice were lysed in lysis buffer (30 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM potassium acetate, 3.5 mM magnesium acetate, 1 mMDTT
，0.1％V/v Triton X-100，20％V/V甘油和1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1 mm 4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟氟化物盐酸盐（Sigma ，A8456）
，A8456，A8456 ，0.3μmPortinin
，40μmbetaninhy Hyy-mmbetroride，（Sigma ，E3132）
，10μM亮肽素半硫酸盐） 。在4°C下以20,000g（S20）澄清30分钟的粗细细胞质裂解物
。使用Bradford分析测量S20蛋白浓度。将S20与抗晶状传感珠一起在4°C下孵育过夜 。除去上清液，并用裂解缓冲液洗涤三次 ，但含有1 M乙酸钾（高盐水），然后用裂解缓冲液两次
。通过与200 ng µl -1 3×FLAG肽在4°C下孵育2小时
，将结合的蛋白质洗脱。通过蛋白质印迹测定了耗尽的程度 。简而言之，将样品在SDS -PAGE上解析 ，并转移到硝酸纤维素膜（Amersham protran 0.45 NC
，Cytiva）
。使用小鼠抗FLAG抗体（Sigma，F1804; 1：1,000在阻止缓冲液 ，Rockland ImmunoChemicals
，MB-070）和兔抗微管蛋白（细胞信号，2144; 1：1,000）使用小鼠抗FLAG抗体进行探测2小时。用TBS洗涤5×（+0.1％V/V tween-20）后 ，将膜与继发抗体一起孵育 - Donkey抗兔IRDYE 680RD（LI-COR
，926-68073; 1：15,000）和山羊抗Mouse Irdye 800CW（Li-Cor（Li-Cor）（926-322210）；将膜用TBS（+0.1％V/V Tween-20）洗涤5×，并使用Odyssey红外成像系统（LI-COR）进行成像 。 　　如上所述进行了北印迹。简而言之 ，PIRNA引导标准标准和PIWI RISC首先在变性15％聚丙烯酰胺凝胶上解析
，然后通过在20 V下半干式转移到Hybond-Nx（Cytiva）中性尼龙膜中转移到Hybond-Nx（Cytiva）中性尼龙膜中
。接下来，在0.16 M EDC存在0.13 m 1-甲基咪唑 ，pH 8.0，60°C下进行1小时进行交联。在教堂的缓冲液（1％w/v BSA
，1 mM EDTA，0.5 M磷酸盐缓冲液和7％W/V SDS）中 ，将交联的膜预先杂交1小时 。在教堂的缓冲液中
，将放射性标记的5'32p-DNA探针（25 pmol）添加到膜上，并在45°C杂交过夜 ，然后用五个洗涤五个用1×SSC洗涤
，其中含有0.1％W/v SDS
。膜被空气干燥，并暴露于储存的磷光筛网中。 　　使用10笔宽松的杵A中的裂解缓冲液中解剖的动物组织在Dounce均质器中均匀 ，然后用20杆的20杆紧身牢络B 。裂解物以20,000克阐明
，然后进行0.2 µM过滤，以产生S20 ，以获得S20
，以进一步纯化
。直接在30 mM Hepes-KOH，pH 7.5
、100毫米乙酸钾 ，3.5 mm乙酸镁，1 mM DTT和20％V/V甘油（“透析缓冲液
”）中直接制备未经进一步纯化的裂解物
，乙酸钾，3.5 mm。测定前 ，将列级分透析到该缓冲液中 。使用BCA测定法测量蛋白质浓度
。在使用前对色谱缓冲液进行过滤。 　　对于色谱
，除了使用30 mM HEPES-KOH，pH 7.5、50 mM NaCl ，1 mM DTT
，5％V/V甘油和蛋白酶抑制剂外，还制备了裂解液 。将裂解物应用于用裂解缓冲液平衡的HITRAP SP柱（Cytiva）
。将色谱柱洗涤 ，并使用增加的NaCl浓度逐步洗脱结合的蛋白。将含有峰值MIWI键盘活性的SP柱级分的NaCl含量调节到2 m
，并应用于含有2 M NaCl的柱缓冲液平衡的HITRAP苯基（Cytiva） 。使用降低的NaCl浓度逐步洗脱结合的蛋白质。汇总了HITRAP苯基柱的峰值MIWI-POTENTIATION分数，集中浓缩（10 kDa Mwco Amicon Ultra滤波器） ，并应用于SuperDex 200增加10-300 GL尺寸散布色谱色谱柱（床体积〜24 mL）与透明度的Buffer平衡
，但含有5％V/V glycerol
。凝胶过滤柱的空隙体积（V0）用蓝色葡萄糖确定，所有分数（每个0.5 mL） ，从V0开始之前，从V0到列的末端（VT）开始
，用于MIWI-POTENTITITITATIT活性。增强活性的分子质量是相对于分子质量标记的（β淀粉酶，200 kDa；酒精脱氢酶 ，150 kDa;白蛋白
，66 kDa;碳纤维藻类酶，29 kDa;和CytoChrome C ，12.4 kDa） 。 　　HITRAP螯合HP（Cytiva）柱子用0.1 M Niso4或ZnSO4充电
，用水洗涤，然后在柱缓冲液（20 mm磷酸钾缓冲液 ，pH 7.5
，500 mm NaCl，0.5 mm dtt ，0.5 mm DTT
，5％V/V/V甘油中）平衡
。将S20睾丸裂解物应用于色谱柱，收集流通液 ，并用柱缓冲液洗涤色谱柱，直到在280 nm稳定下吸光度为止。Bound proteins were eluted in two steps: first, with 20 mM potassium phosphate, pH 7.5, 2 M ammonium chloride, 0.5 mM DTT, 5% v/v glycerol (elution buffer 1), and, second, with 20 mM potassium phosphate, pH 7.5, 500 mM NaCl, 200 mM imidazole, pH 8.0, 0.5 mM DTT, 5% v/v glycerol（ElutionBuffer 2） 。将每个步骤的峰透析到透析缓冲液中
，并测定能够增强MIWI催化的能力
。 　　如上所述，制备了用于体外切割测定的目标RNA底物。简而言之 ，通过PCR扩增了PIRNA靶标模板
，并在体外用T7 RNA聚合酶转录，用尿素页纯化 ，并使用α-32P GTP（3,000 CI MMOL-1; Perkin Elmer）进行放射性标记
，s-腺苷甲基二氨基氨基氨基氨基酶，以及）的含量rna guany guanyl guanyl guanyl guanyl huanyly guanyl huanyly guanyl huanyly guanyl huanyly guAnyly ly huanyly guanyl 。使用G-25自旋柱（Cytiva）去除未纳入的α-32P GTP ，并纯化靶RNA
。在扩展数据图8a中
，使用合成RNA寡核苷酸通过连接[5'-32p] cytidine 3'，5'-双磷酸到靶端的T4 RNA连接酶I（Ambion）的3'端来监测靶裂解。通过将1 mm胞苷3'-单磷酸（Sigma）与312.5 pmol [γ-32P] ATP（6,000 CI Mmol-1; Perkin Elmer）与25 U T4 PolynucleeTase Kinase（Neb）37°C在37的37°C中 ，在312.5 pmol [γ-32P] ATP（6,000 CI mmol-1; Perkin ci mmol -1; perkin）中
，在312.5 pmol [γ-32p] ATP（6,000 ci mmol -1; pmol）°C中孵育1毫米，在37°30分钟使激酶失活 。 　　将放射性标记的靶（3-100 nm终浓度）添加到纯化的piwi pirisc（2-8 nm）中 ，加上〜1μg的组织或分类的生殖细胞裂解物，每10μl反应体积或0.5μm（最终浓度）纯化的GTSF蛋白
。在指定的时间
，将主反应的等分试样在4卷中淬灭50 mm Tris-HCl，pH 7.5 ，100 mM NaCl
，25 mM EDTA，1％W/V SDS ，然后将蛋白酶K（1 mg ml-1终浓度）添加并在45°C下孵育15分钟。将等量的尿素载荷缓冲液（8 m尿素
，25 mm EDTA）添加到反应时间点，在95°C加热2分钟 ，并通过7-10％的变性页解决 。将凝胶干燥
，暴露于储存磷光器屏幕上，并在台风FLA 7000（GE Healthcare）上成像。 　　原始图像文件用于量化基板和产品范围 ，并纠正了背景
。数据适合反应方案 　　使用突发和稳态的方程： 　　产物形成的时间依赖性对应于稳态的指数爆发（Kburst = K2+K3）
，然后是kCAT描述的线性稳态相，其中kCat = kss = kss = k2k3/（k2+k3）。 　　野生型或GTSF1（W98A/W107A/W112A）的亲和力（KD）对Miwi Pirisc-target三元体复合体和最大可观察率（KPOT）的亲和力（KD）是通过测量MIWI和MIWI的最大可观察率（KPOT）来估计的 。数据70到等式（2）： 　　使用Igor Pro 8绘制所有数据
。 　　用X-三分元HP DNA转染试剂（Sigma）将表达标记为标记的BMSIWI ，MIWI或MILI的载体转染到BMN4细胞中。如下所述，负载裂解物和单链RNA负载的制备 。在细胞裂解液中加载合成引导RNA后
，用抗FLAG抗体（Sigma）对Dynabeads蛋白G超透明磁珠（Thermo Fisher Scientific）进行免疫沉淀
。将珠子用含有30 mM HEPES-KOH的裂解缓冲液洗涤5次，pH 7.4 ，100 mm乙酸钾
，2 mm乙酸镁，0.5 mm DTT和0.1％V/V/V膜。在25°C的8μl反应中 ，在含有2.4μl'40×'反应混合69 、100 nm重组GTSF1蛋白和0.5 nm 32p Cap-RadioLAdioLAbell的靶RNA中
，在25°C下进行目标切解测定3.5 h 。 　　将幼稚的BMN4细胞重悬于裂解缓冲液中（30 mm Hepes-KOH，pH 7.4 ，100 mm乙酸钾
，2 mm乙酸镁，0.05％V/V Triton X-100 ，0.5 mm DTT
，1×完整的EDTA无eDTA无eDTA蛋白酶抑制剂（ROCHE）和LYSED，使用Lysegendize和lysogen
。在4°C下以17,000克离心20分钟后 ，将上清液在4°C下与抗Bmago3抗体在4°C下孵育1小时，如所述73与Dynabeads蛋白G（Thermo Fisher Scientific）偶联。用洗涤缓冲液（30毫米Hepes-KOH
，pH 7.4，100 mm乙酸钾 ，2 mm乙酸镁
，0.5％V/V Empigen，0.5％V/V Triton X-100 ，0.5 mm DTT）用洗涤缓冲液（30 mm HEPES-KOH
，pH 7.4，100 mm乙酸钾 ，2 mm乙酸钾
，2 mm）洗涤5次 。在含有2.4μl40倍反应混合物，55 nm的重组蛋白和0.5 nm 32p cap-radiolabellabell的靶标1（与内源性PIIRNA）或靶标2（由内源性4的疾病中）相吻合的4μl反应中 ，在25°C下进行目标切解测定2.5 h 2.5 h 2.5 h 2.5 h
。 　　如上所述35纯化了efpiwi pirisc。将纯化的EFPIWI PIRIS（终浓度为100 nm）在37°C下与5'-32P-Radiolabeld的5'-32p-Radiolabeld靶RNA在反应缓冲液组成的G2 – G21（10 nm终浓度）中互补
，由20 mm Tris，pH 8.0 ，100 mm Nacl，2 mm Nacl
，2 mm mmgcl2，2mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmn和0.5.5在指示的情况下 ，还包括纯化的E. muelleri GTSF1（500 nm终浓度）或0.1 mg ml -1贝克的酵母tRNA 。通过将每个反应的等分试样与等体积的凝胶载荷缓冲液混合（98％w/v formamide
，0.025％W/V二甲醇，0.025％W/V Bromophenol Blue ，10 mm EDTA
，pH 8.0），从而停止了目标裂解。通过贬低页（15％）解决完整和分裂的靶RNA ，并通过磷光想象可视化
。使用ImageQuant TL（GE Healthcare）对信号进行定量。 　　如上所述
，对小鼠睾丸的生殖细胞进行了分类并纯化 。简而言之，新鲜解剖的小鼠睾丸在33°C的1×gey平衡盐溶液（GBSS）中用0.4 mg ml -1胶原酶IV（Worthington）排列15分钟
。将分离的生精小管用0.5 mg ML -1胰蛋白酶和1μgml -1 DNase I在33°C下1×GBS中处理15分钟。然后通过添加7.5％V/V胎牛血清（FBS）灭活胰蛋白酶 。将细胞悬浮液通过70μm的细胞滤网过滤 ，并在4°C下以300g颗粒筛分10分钟
。在33°C下用5μgmL-1 Hoechst 33342在1×GBS
，5％V/V FB和1μgml-1 DNase I中进行细胞染色15分钟，然后用0.2μgml-1 propidium iodium iodium iodium iodium iodide处理细胞 ，然后通过iodide进行最终通过40-μmml-clainserers，然后再分类40-μmmmmmmmmmmm。将排序的细胞在100克固定5分钟
，去除缓冲液，并将细胞颗粒闪烁并储存在-80°C下 。如HEK293T细胞所述制备细胞裂解物
。使用BCA分析估算蛋白质浓度 ，并使用每种细胞类型的总蛋白质等量来测定增强MIWI催化的能力。 　　分析了公开可用的数据集17,75,76,77 。使用默认参数的Bowtie 2.2.5删除rRNA读取78
。去除rRNA后
，将其余的读取映射到相应的基因组（小鼠，MM10；大鼠 ，RN6； Macaque
，Rhemac8; Human，hg19） ，使用Star 2.3
，其默认参数允许≤2不匹配和100次映射位置79。以SAM格式生成了映射的结果，使用Samtools 1.880 ，将重复项删除并翻译成BAM格式 。使用默认参数的htseq 0.9.1用于计数唯一的映射读数81（据报道
，稳态的转录物丰度在每千千座读数中读取为每百万个唯一映射的读数（RPKM））。 　　重组MIWI被免疫疗法，并通过电泳在4–20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上解决
。固定凝胶 ，用COOMASSIE G-250（简单的蓝色，Invitrogen）染色
，并在UMass质谱核心上切除并分析重组MIWI带。将凝胶切片切成〜1 mm2片，加入1毫升水 ，然后在250 mM碳酸氢苯铵中添加20 µl 45 mM DTT 。将样品在50°C下孵育30分钟
，冷却至室温，然后加入20 µl 100 mM碘乙酰胺并孵育30分钟
。除去溶液 ，并用1 ml水
，1 ml 50 mM碳酸氢铵洗涤凝胶片：乙腈（1：1），用200 µl乙腈淬火 ，并在Speedvac中干燥。然后将凝胶片在50 µL 50毫米碳酸氢铵中再生
，其中含有4 ng µl -1胰蛋白酶（Promega，Madison ，Wi）和0.01％Proteasemax（Promega）
，并在37°C孵育18小时 。收集上清液，并用200 µL和80:20的乙腈溶液提取：1％V/V甲酸在水中
。然后将上清液组合在一起 ，并将肽冻干在Speedvac中，并重悬于25 µL 5％乙腈
，0.1％V/V甲酸中，并进行质谱分析。使用与Orbitrap Fusion Lumos Tribrid（Thermo Fisher Scientific）质谱仪耦合的纳米级UPLC（Waters Corporation）获取数据 。使用内部直径100 µm内直径融合的储物前（kasil frit）包装的肽将肽捕获和分离（Bischoff;100Å ，3 µm）培养基
。流动期A在水中为0.1％v/v甲酸；流动相B为乙腈中的0.1％V/V甲酸。在注射3.8 µL后
，以4 µL/min的流速将肽用5％B捕获4分钟， 然后以300 nl min -1的流速从90分钟内的5–35％B（总运行时间为120分钟）以梯度洗脱 。电喷雾电压是通过位于圆柱之间的液体连接电极（1.5 kV）传递的 ，将毛细管传递到质谱仪的传递在275°C
。在M/Z 300–1,750 DA上获得质谱
，分辨率为120,000（M/z 200），最大注射时间为50 ms ，AGC目标为400,000。使用数据依赖性采集（3 s周期）获取串联质谱
，其隔离宽度为1.6 DA，HCD碰撞能量为30％ ，分辨率为15,000（M/z 200）
，最大注射时间为22 ms，AGC目标为50,000 。 　　使用Proteome Discoverer 2.1.1.21（Thermo Fisher Scientific）处理原始数据 ，并使用Swiss-Prot Human Database执行的吉祥物2.6.2（Matrix Science）执行的数据库搜索（2019年9月4日下载； https://wwwww.uniprot.org/）。搜索参数为：最多两次错过的裂解的半特殊消化；前体质量公差10 ppm;碎片质量耐受性0.05 da;肽N-末端乙酰化，半胱氨酸氨基甲基化
，蛋氨酸氧化，N末端谷氨酰胺对丁酸谷氨酸转化 ，精氨酸甲基化和精氨酸脱甲基化
，指定为可变修饰
。肽和蛋白质验证和注释是在使用肽Prophet82和蛋白质Prophet83的脚手架4.8.9（蛋白质组软件，OR）中进行的。将肽在1％的FDR中过滤 ，而蛋白质鉴定阈值设置为99％的概率
，并且每个蛋白质最少有两个鉴定的肽 。图中仅报告了来自单独的免疫沉淀实验的所有三个重复的精氨酸修饰位点
。 　　图1b，3 ，4b
，c和5a以及扩展数据图4a显示平均值±S.D。三个独立试验 。图2a，b ，扩展数据图
。1A – C
，H和6A显示了三个独立试验，结果相似。图2E ，F和扩展数据图 。1f，g
，2b，3a ，c和5显示了两个独立试验
，结果相似
。图2中的实验。1C和4A以及扩展数据图 。1d，e ，2a
，3b，d – h ，4b
，6b和8a，b进行一次
。使用Clustal Omega对齐蛋白序列（1.2.4）；使用默认参数84的随机轴突最大似然（RAXML 1.0.0）构建未根的树 ，并在Life85的交互式树中可视化。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。