祖先细胞认同网络的消除可实现C4光合作用

　　对于De-petiolation时间过程 ，Oryza sativa spp的种子。Japonica品种Kitaake和高粱双色BTX623分别在无菌水中孵育两天和一天
，在黑暗中的29°C下 。将发芽的幼苗转移到一个黑暗的房间中，配备绿光到表土和补充肥料颗粒的1：1混合物 ，并在黑暗中生长了五天
，并用铝箔纸将托盘包裹好几次
。植物被放置在湿度60％的受控环境室中，白天和黑夜的温度分别为28°C和20°C。植物在光周期的光周期开始时暴露在光中 ，深色12小时，并通过液氮中的闪光冻结组织在去脱位期间在不同的时间点收获芽 。对于0小时的时间点
，在一个配备绿灯和闪光的黑暗房间里收获了幼苗
。 　　用于显微镜分析和使用荧光激活的核分类对束鞘核的富集，O。sativa spp 。Japonica品种Kitaake单拷贝纯合T2种子被除外 ，并在10％（v/v）漂白剂中灭菌30分钟。用无菌水洗涤几次后
，将种子在黑暗中的29°C下在无菌水中孵育两天
。发芽的幼苗被转移到洋红色的半强度murashige和Skoog培养基中，在白天和黑夜的温度分别为28°C和20°C的生长室中 ，在生长室中生长了五天
，并在白天和20°C下生长，以及12小时光的光孔。 　　为了生成稻束式标记线的构建体 ，Mturquoise2的编码序列是从先前的Report43获得的
，并从先前的Report44中获得了Zoysia Japonica Japonica磷酸烯醇丙酮酸羧基酶的启动子序列与Dtale Stap4系统结合使用 。拟南芥H2B（AT5G22880）的编码序列用作将mturquoise2靶向核的N末端信号
。所有序列均以金门克隆为驯化45,46。使用金门克隆策略组装了1级和2级构造，以创建一个二进制向量 ，以表达由PCK-DTALE驱动的Stap4-Mturquoise2-H2B 。 　　对于水稻原生质体中的反式激活测定
，在赋予Golden Gate克隆序列41,42（OSDOF2，LOC_OS01G15900 ，OSDOF8，OSDOF8
，LOC_OS_OS02G45200，LEC_OSDOF23 ，osdof23
，osdof2，osdof2 ，osdof2
，osdof2，osdof2 ，osdof2
，osdof2，osdof2 ，osdof2
，osdof2，osdof2 ，osdof2，osdof2
，osdof2，osdof2 ，osdof2
，LOC_OS10G26620，SBDOF2 ，SOBIC.003G121400
，SBDOF8，SOBIC.004G284400 ，SBDOF11
，SOBIC.001G4899900和SBDOF17，SOBIC.006G182300）
。如前所述37 ，将编码序列与Zea Mays UBI启动子和TNOS终结器模块组装到1级模块中。对于最小的SIR启动子
，核苷酸–980至–829以及内源性核心启动子（核苷酸–250至+42）与荧光素酶报告基因融合以测量转录活性37 。 　　为了生成GUS报告基稻系，将最小的SIR启动子组装到1级模块中 ，如先前所述，KZGUS（GUS Reporter Gene的无固有版本）的编码序列（GUS Reporter Gene的无固有版本）和TNOS终结器如前所述37
。使用PCR扩增将最小SIR启动子中的DOF基序突变。 　　Oryza sativa spp 。如先前所述47所述
，使用农杆菌进行了几种修饰，使用农杆菌进行了japonica品种kitaake
。将种子除外 ，并用10％（v/v）漂白剂灭菌15分钟
，然后将其放在含有2 mg L-1 2,4-二氯苯氧基乙酸的营养肉汤（NB）愈伤组织诱导培养基上，在黑暗中28°C下进行四个星期。将生长的calli与曲霉曲霉菌株LBA4404共孵育 ，该菌株在NB接种培养基中带有感兴趣的表达质粒
，其中含有40μgml-1 a​​cotosyringone，在黑暗中22°C下三天 。将Calli转移到含有300 mg -1 timentin的NB恢复培养基中 ，在黑暗中28°C下一周。然后将它们转移到含有35 mg L -1湿霉素B的NB选择培养基中
，在黑暗中28°C下四个星期
。随后将增殖的calli转移到含有100 mg L-1肌醇，2 mg L-1动力素 ，0.2 mg L-1 1 1-萘甲基酸酸的NB再生培养基中
，在28°C下在28°C下在28°C下四个星期。将植物体转移到含有0.1 mg l-1 1 1-萘甲酸酸的NB生根培养基中，并在28°C的光线下在洋红色锅中孵育两个星期 。最后 ，将植物转移到表层土壤和沙子的1：1混合物中，并在湿度为60％的受控环境室中生长
，白天和黑夜分别为28°C和20°C的温度和20°C，以及12小时光的光周期和12小时的光周期
。 　　如先前所述37,48 ，进行了稻原生质体分离。使用金门1级模块进行转化原生质体
，该模块设计用于转录因子的组成型表达，以及Luc Reporter和Zmubipro :: Gus-TNOS转化控制 ，它们是用Zymopure II质粒MIDIPREP KIT制备的 。转化混合物含有2 µg对照质粒
，5 µg报告基因质粒和5 µg转录因子质粒，这些质粒被转化为180 µL原生质体
。在光中孵育原生质体20小时后 ，使用被动裂解缓冲液（Promega）提取蛋白质
，并用20 µL的蛋白质提取物测量GUS活性。使用荧光测定杯（4-甲基固定-β--葡萄糖剂）测定法来定量含有50 mm磷酸盐缓冲液（pH 7.0），10 mM EDTA-NA-NA2 ，0.1％（V/V/V/v/v/v）Triton x-1％（v/v）triton x-1％（w/v）的反应混合物中的Gus活性49DTT和2毫米杯子 。在37°C下进行测定
，并使用Clariostar读取器每2分钟记录每2分钟以360 nm激发和450 nm发射的20个循环的4-甲基固体（4-mu）荧光
。另外，使用20 µL蛋白质样品和100 µL的LUC测定试剂确定LUC活性。相对于每秒MU积累速率 ，将转录活性定量为LUC发光 。 　　如先前所述49进行的，进行了GUS染色
，并进行了较小的修改
。在4°C下将叶组织固定在90％（v/v）丙酮中12小时。用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤后，将样品转移到1 mg ML-1 5-溴-4-氯-3-氯糖苷（X-GLUC）GUS染色溶液中 ，并将真空吸收到5次 。将样品在37°C下孵育48小时。为了清除叶绿素
，将样品在室温下在90％（v/v）乙醇中孵育
。用剃须刀制备横截面，并用Olympus BX41光学显微镜拍摄图像。 　　为了量化GUS活性 ，使用200 mg成熟的叶组织
，使用了上述荧光杯测定49 。使用十个4-MU标准的标准曲线来确定每个样品中的4-MU浓度
。 　　为了测试mturquoise2-h2b的捆绑外丝特异性表达，通过刮擦叶片叶片的近距离侧面两到三倍 ，用锋利的剃须刀刀片刮擦
，以避免向上的表面表面上的表面悬挂，然后将其转移到水面上 ，从而制备了最近扩展的七日幼苗的叶子3叶3次
，用于共聚焦显微镜。使用10×空气物镜（HC PL APO CS2 10×0.4 DRY）在Leica TCS SP8 X上进行共聚焦成像，并使用光学变焦进行杂交探测器 ，用于荧光蛋白和叶绿素自动荧光检测 。使用以下激发（EX）和发射（EM）波长进行成像：mturquoise2（ex = 442，em = 471–481）
，叶绿素自动荧光（EX = 488，EM = 672–692）
。 　　对于水稻和高粱的去限实验 ，收集了每个时间点的四到六个单个幼苗的样品（0 h
，6 h，12 h ，12 h和48 h）以进行电子显微镜。将叶片片段（约2 mm2）用剃刀叶片切除
，并立即固定在2％（v/v）戊二醛中，并在0.05-0.1 m钠cacododylate（NACAC）缓冲液（pH 7.4）中固定在0.05-0.1 m钠中 ，含有2 mm的钙 。将样品真空浸润过夜
，在0.05-0.1 M NACAC缓冲液中洗涤五次，并在1％（v/v）四氧化水溶液中固定 ，在0.05 M NACAC缓冲液中
，在4°C的0.05 M NACAC缓冲液中，1.5％（w/v）铁蛋白糖钾
。放置后 ，将样品在去离子水中洗涤五次，并在室温下在黑暗中固定在0.1％（w/v）硫果酰氢化氮酰胺中20分钟。然后将样品在去离子水中洗涤五次
，并在室温下在2％（v/v）四氧化水溶液中第二次渗透1小时 。将样品在去离子水中洗涤五次，随后在0.05 m maleate缓冲液（pH 5.5）的2％（w/v）乙酸铀酰中染色3天 ，在4°C下进行三天
，然后在去离子水中洗涤五次
。然后将样品在乙醇系列中脱水，然后转移至丙酮 ，然后转移到乙腈。将叶片样品嵌入喹酚651个树脂混合物（TAAB实验室设备）中
，并在60°C固化两天 。准备嵌入的叶片样品的超薄部分，并将使用导电碳片（Taab Laboratories设备）安装在铝制SEM固件上的Melinex（Taab Laboratories设备）塑料盖上0.2 Na探头电流 ，使用无田（低磁化）或浸入（高磁化）模式（工作距离3.5–4 mm
，停留时间3 µs，1,536×1,024像素分辨率）中的同心反向散射检测器（高磁化）模式（高磁化）模式。对于质体超大型结构 ，使用FEI Maps自动采集软件以10,000×放大倍率获取了SEM缝合地图
。图像的灰度对比是倒置的
，以更容易可视化。 　　To purify the nuclei population from whole leaves, recently expanded leaves 3 from five seven-day-old wild-type rice seedlings were chopped on ice in nuclei buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5 mM spermidine, 0.2 mM spermine, 0.01% Triton X, 1× Roche complete protease inhibitors, 1% BSA and保护剂RNase抑制剂）带有锋利的剃须刀 。通过70毫米过滤器过滤悬浮液，然后通过35毫米过滤器过滤
。用hoechst染色 ，并使用70毫米喷嘴在Ariaiii仪器上通过荧光激活的细胞分选（FACS）进行纯化。将核收集在含有BSA和保护酶RNase抑制剂的Eppendorf管中 。使用相同的方法，分离了表达mturquoise2-h2b的束式套件标记线的核
。根据mturquoise2荧光信号对核进行分类。在最小的核缓冲液（10 mM Tris-HCl
，pH 7.4、10 mM NaCl，3 mM MGCL2 ，RNase抑制剂和0.05％BSA）中收集核 。收集后
，将核在405g的摆桶离心机中旋转5分钟，加速和减速降低
。将核重悬于最小的核缓冲液中 ，并与Unspun全叶核种群混合
，以达到约25％mturquoise2阳性核的比例。使用具有v.3.1化学的10倍基因组基因表达平台对束富含束的核种群进行了测序，并在Illumina Novaseq 6000上对150 bp配对的化学进行了测序 。 　　在去源化期间在指定的时间点收获幼苗 ，并在液氮中立即闪烁
。将冷冻的组织粘在细粉中
，并在将组织悬浮在1 ml的80％（v/v）丙酮中之前测量重量。涡旋后，将组织在冰上孵育15分钟 ，偶尔混合悬浮液 。在4°C下以15,700克的旋转旋转
，并去除上清液。重复提取，并在分光光度计中测量663.6 nm和646.6 nm的吸光度之前 ，将上清液合并
。如前所述50确定总叶绿素含量。 　　从每个时间点（每个时间点一个生物学重复，八个时间点）从珠子敲击方法粉碎
，并通过重新悬浮核中释放核中的冷冻组织（八个时间点） 。所得悬浮液通过30μm的滤波器
。为了丰富核的过滤溶液，使用了optiprep（Sigma）梯度。然后用Hoechst对富集的核进行染色 ，然后纯化（BD Influx软件v.1.2.0.142） 。纯化的核在具有V.3.0化学的10倍基因表达平台上运行
，并在Illumina Novaseq 6000上测序，并具有150 bp配对的化学
。按照制造商协议制作了单细胞库。将文库的平均饱和度测序为63％（14％S.D.） ，并与大米（O. sativa
，subspecies nipponbare; MSU注释）或高粱（S. bicolor v.3.0.1; JGI注释）52基因组对齐 。去除叶绿体和线粒体读数
。对于每个时间点，对两个物种的平均平均分子标识符（UMI）为平均中位唯一的分子标识符（420 S.D.） ，平均为12,524个核（6,405 S.D.）。使用DoubleTfinder53删除双线 。 　　每种冷冻幼苗（每个时间点10-12个单个幼苗）均使用96孔板中的珠子扑打方法粉碎
，此后将匀浆重悬于核缓冲液中
。导致的悬浮液通过30μm的滤波器。然后用特异性底漆对洗涤的核进行逆转录 。在此步骤之后，按照先前概述的26概述了SCI-RNA-SEQ3的剩余池和拆分步骤。我们注意到使用相同的方法来对48小时的时间点进行测序
。但是 ，使用六种植物的种群代替单个幼苗。将库的平均饱和度测序为80％（5％S.D 。）
，并在Illumina Novaseq 6000上测序，并使用150 bp配对的化学方法进行了测序
。如上所述 ，将读数与大米或高粱基因组对齐。去除叶绿体和线粒体读数 。对于0–12小时的时间点，对两个物种的平均平均为6,527个核（5,039 S.D.）
，平均中位数为423（41 S.D.）
。对于48小时的时间点，将77,208和82,748个核分别用757的中位数为757和740 ，分别为水稻和高粱。 　　0或12小时的轻处理后收集新鲜的幼苗组织（每个物种两种生物学重复
，每个生物学重复，每个时间点两到四个技术重复； n = 11） 。在Nuclei缓冲液中的绿色房间条件下 ，在冰上切碎新鲜组织
。使用30μm滤波器过滤所得的匀浆。使用optiprep梯度富集核 。没有进行FACS
。核在具有V.1.0化学的10倍多组平台上运行。按照制造商的协议制作了单细胞库
，并在Illumina Novaseq 6000上进行了测序，并配对150 bp配对的化学 。如上所述 ，将读数与大米或高粱基因组对齐。去除叶绿体和线粒体读数
。对于每个样品
，对平均1,923个核进行了测序（1,334 S.D.），平均中位UMI为1,644（646 S.D.）和中位ATAC片段10,251（7,001 S.D.）（7,001 S.D.）。 　　使用seurat54为每个物种分别生成转录地图酶 。首先在各个时间点（范围为0到48 h）和方法（10x和SCI-RNA-SEQ3）汇总核
。集成的数据集经过集群 ，使用了所有数据集共享的前2,000个变量功能。每个簇都包含从所有时间点采样的核
，表明聚类主要由细胞类型驱动，而不是暴露于光线后的时间（扩展数据图2） 。随后的UMAP预测是使用前30个主要组件构建的
。使用发现的基因 ，分别在响应光作为可变特征的基因上表达了大米和高粱中的叶叶叶和束鞘子簇的UMAP投影。为了分析米束特异性mturquoise系列，我们将两个处理重复集成到一个统一的数据集中 。对于此数据集
，我们使用前30个主要组件聚类
。使用findmarkers（）命令（调整后的P值）识别特定于集群的标记< 0.01). To determine the correspondence between the mTurquoise-positive cluster and clusters within the rice-RNA atlas, we compared the lists of cluster-specific markers (adjusted P value 0.01, specificity > 2）从大米地图集那里获得的。对于10倍 - 型（RNA+ATAC）聚类，我们使用了Signac55 。整合了每个物种的生物和技术重复 ，并使用从表达数据得出的前50个主要成分进行聚类
。在使用细胞游舱（10倍基因组学）的初始峰调用之后
，随后使用MACS2重新计数峰（参考文献56）。使用findmarkers（）命令（调整后的P值< 0.05, per cent threshold >0.3），在与最近的基因相关联（转录起始位点的±2,000 bp）之前 　　我们使用Orthofinder 57确定了水稻和高粱之间的基因直系同源物 。我们通过选择具有跨物种直系同源物的大米和高粱基因来构建泛曲转录组。为了构建泛文章图集 ，以一对一的方式进行直系同源性转换
，这意味着，如果在跨物种之间发现了一个基因的多个直系同源物 ，则只保留了一个基因
。我们使用上述聚类方法将这些数据集与Seurat集成在一起。为了分配细胞身份
，我们将先前分别分配给每个物种的细胞类型标签上绘制在泛转录组簇上 。为了评估该数据集中高粱和大米的捆绑套装簇中基因表达的特定转录差异，我们使用了Findmarkers（）命令（调整后的P值< 0.05). Sorghum DOF transcription factor orthologue names kept the same numerical identifier as their rice orthologues. 　　To examine the overlap of cell-type-specific gene-expression markers between the two species, we identified cell-type markers from our main transcriptional dataset using FindMarkers() (adjusted P value < 0.05, min.pct >0.1）
。我们注意到 ，发现某些基因在多种细胞类型中很重要。为了评估跨物种细胞类型之间的重叠的重要性
，我们将基因转换为正群，并进行了Fisher的精确检验 ，数据集中的正group总数为背景 。每种细胞类型的保守标记基因的比例范围从叶叶酸的43％（在高粱中保守的426个水稻标记基因中的184％）到束鞘的13％（在高粱中保存的229个水稻标记基因中，有31个）
。我们注意到
，通过依靠正式群，我们将高级矫正关系超出了一对一的方式。 　　接下来 ，我们评估了每个细胞类型对之间基因表达模式的一致和差异分配（总计15对） 。为此
，我们首先通过在0-12小时的时间点上通过单个细胞类型的伪膨胀转录组来计算每个细胞类型对的差异表达基因
。接下来，我们使用DESEQ2中实现的ANCOVA模型鉴定了细胞类型之间的分区表达模式（调整后的P <0.05）。为了对细胞类型对进行跨物种比较 ，我们首先将差异表达的基因转换为原群 。然后
，我们使用正群成员资格将每个细胞类型对重叠，并使用Fisher的精确检验评估了这些重叠的重要性 ，而正构成总数为背景
。最后
，为了区分特定细胞类型中的基因是在特定细胞类型中显示一致还是差异分区，我们检查了其折叠变化的表达是与其他物种的相应细胞类型中的折叠变化表达相比。 　　我们通过伪膨胀的转录曲线发现了在光的前12小时内发现细胞类型特异性差异表达的基因 。为了为每种细胞类型创建伪膨胀曲线 ，我们首先通过重新群叶叶叶簇
，表皮和脉管系统细胞类别进行了完善，然后才选择最强烈表达的已知细胞型标记基因的子簇。对于每种单元格类型 ，我们计算了这些批量轮廓的第一和第二个主要成分，并通过将线性模型拟合到这些主体组件
，以及使用DESEQ2随时间线性响应的线性模型差异表达的基因（调整后的P <0.05）
。我们将细胞核被测序（10x或SCI-RNA-SEQ3）作为协变量的测定法。在此差异表达基因的列表中，我们还包括在成对测试中在时间点0 h和12 h之间差异表达的基因（调整后的P <0.05） 。接下来 ，为了揭示差异表达基因之间基因表达的不同趋势
，我们使用层次聚类聚类，选择聚类的截止点 ，从而产生了10个大米和18个含有至少10个基因的大米和18个高粱簇
。为了可视化这些簇的表达
，我们缩放了表达式并拟合了非线性模型以捕获主要的表达趋势。通过细胞类型的伪造染色质发现，可以在规范光合作用基因中获得可访问的染色质 。可接近的峰需要在基因体的2,000 bp之内
。每一个基因仅保留一个峰进行后续分析 ，并去除极端异常值（约占所谓峰的5％）。为了比较物种之间的峰值可及性
，每个峰值的读数在0到1之间重新归一致 。使用学生的t检验（单方面）评估了这组基因的细胞类型之间的可访问性差异
。 　　为了识别与大米和高粱叶中交换表达模式的细胞类型特异性基因相关的GO术语，我们使用基于Web的基于Web的工具Agrigo V.2.0（参考文献58）进行了奇异的富集分析。Oryza sativa或S. bicolor基因标识符用于输入样品列表 ，并且各个植物物种的整个基因组被用作背景 。 　　我们使用在Signac中实现的Chromvar函数59检测到了每个单元格类型中细胞类型的可访问基序
。简而言之
，这种方法检测到Jaspar2020植物分类组60中代表性过多的顺式调节元素之间在细胞型簇中差异差异。用于统计检验的GC富集和基因组背景源自BSENOME组装的基因组61 。还使用了相同的方法来检测光响应性的顺式元素，使用每种细胞类型中的光和深色处理的核。在使用所有计算的基序计算所有计算的基序之前 ，在计算Fisher的精确测试之前，使用所有计算的基础作为背景
，然后使用TOBIAS62群集群集，我们在计算Fisher的精确测试之前 ，通过选择最显着代表性的基序（调整后的P <0.05）来重叠的富集的顺式调节元件（调整后的P <0.05）
。 　　为了在我们的多组基因表达数据集中找到一致和差异分配的直系同源基因
，我们使用findmarkers（）命令分别在水稻和高粱中分别发现了叶叶叶和束鞘特异性基因，其p值阈值coft coft 0.01且表达式特异性均为1.25。为了在差异分配的基因中找到过度代表性的基序 ，我们使用linkpeaks（）命令将峰值可及性与基因表达相关联
，并且仅保留与基因表达显着相关的峰 。我们使用FindMotifs（）命令确定了这些峰内富集的顺式元素；按显着性排名（调整后的P <0.05）
。由于所产生的显着性取决于选择作为背景的基因组的子集，因此我们迭代了100个排列的FindMotifs（）命令 ，以对始终报道为富集的基序进行排名。然后
，我们在100个排列中平均每个图案的等级，以创建最终排名的值（补充表13） 。 　　为了量化DOF结合位点的发生 ，我们提取了与转录起始位点接近的峰的基因组序列（±1,500 bp）
。如果峰值靠近两个转录起始位点
，则将其分配给更近的一个。然后，我们实施找到单个基序的情况（FIMO）来量化这些染色质区域内的DOF共识位点的数量（P值阈值= 0.005） 。我们选择DOF2（MA0020.1）基序作为核心DOF共识序列AAAG的代表
。 　　我们实施了对图案富集（AME）的分析 ，以检测富含laxum（http://phytozome-next.jgi.doe.goe.gov/info/info/claxum_v1_1）的DOF转录因子图案，始终划分为大米和高粱束鞘的基因。为了识别同源物
，通过比较编码序列使用NCBI BLASTN工具v.2.15.0，并选择了每个基因的最高识别同源物进行顺式元素富集分析 。我们为每个同源基因使用了转录起始位点上游的1,000 bp ，并针对Jaspar数据库中存在的植物基序进行了测试
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。