新诊断的神经胶质瘤中靶向突变体IDH1的疫苗

　　NOA16是一个非控制的
，开放式标签，单臂 ，多中心
，第一阶段I期试验，用于评估IDH1（R132H）+ ，非1P/19Q CO-DETED
，ATRX，ATRX-WHO 3 WHO 3和4 GLIMAS的IDH1（R132H）患者的八次重复剂量IDH1-VAC的安全性 ，耐受性和免疫原性
。该研究从2015年5月到2018年11月在德国的七个试验中心进行（补充表1）。评估响应
，生存和晚期对手事件的持续时间的后续措施正在进行中 。该研究得到了国家监管机构（Paul-Ehrlich Institute）和机构审查委员会（道德委员会）的批准，在每个研究站点 ，即海德堡医学院伦理委员会（Heidelberg）伦理学委员会
，道德委员会伦理委员会，艾伯特·卢德维格斯·劳德维格斯 - 弗里布尔格（Freiburg） ，弗里布尔格（Freiburg），埃斯特林（Freiburg）
，伯林教学委员会，伯林（Freiburg） ，伯林（Freiburg）
，伯林（Freiburg），伯林（Freiburg） ，伯林（Freiburg）
，伯林（Cerlin ofellin ofellin ofelics ofellin ofelics oferich） Duisburg-Essen (Essen), Ethics Commission of the Medical Faculty “Carl Gustav Carus” (Dresden), Ethics Commission of the Medicine Department of the Goethe University Frankfurt am Main (Frankfurt), Ethics Commission of the Medical Faculty of the Ludwig Maximilians University in Munich (Munich), Ethics Commission at the Medical Faculty of the Eberhard Karls University and at the University Hospital图宾根（Tübingen）
。该研究是根据国际协调会议的良好临床实践指南进行的。所有参与者均提供了书面签名的知情同意书 。我们遵守了所有相关的道德法规
。该试验人群基于患者在入学前接受的SOC治疗组成三个治疗组（TGS）：单独放疗（RT，TG1） ，单独使用TMZ的化学疗法三个循环（Mono-TMZ
，TG2）或与TMZ（RT+CTMZ，TG3）组合。在TG1中 ，放疗后4-6周单独凝视疫苗接种 。在TG2和TG3中
， 疫苗接种是在TMZ单药治疗（TG2）的第10周开始与TMZ并行进行的，或在同步放疗（TG3）后第一个辅助（A）TMZ循环的第10天（TG3）进行疫苗接种
。治疗包括在第1
、3、5 、7
、11、15 、19和23周中使用IDH1-VAC的八次疫苗接种（访问（V）03-10；扩展数据图1B）。为了进行免疫原性评估 ，在六个时间点评估外周T细胞和B细胞免疫反应：V03（基线），V05
，V07，V10 ，V10
，V12和V13（扩展数据图1B） 。Eligibility criteria included the presence of a histologically confirmed IDH1(R132H)+ glioma (with or without measurable residual tumour after resection or biopsy) with absence of chromosomal 1p/19q co-deletion and loss of nuclear ATRX expression in the tumour tissue, thus limiting inclusion in this first-in-humans trial to the subgroup of molecular astrocytoma without positive prognostic因素22
。排除标准包括与地塞米松（或同等）> 2 mg/天的伴随治疗，Karnofsky绩效状况（KPS）<70 <70和进步（包括PSPD14）或SOC之后的复发性疾病。匹配的对照组是由2007年至2018年期间在海德堡中心接受治疗的患者建造的 ，并提供了足够的临床和MRI信息来评估PSPD 。匹配是根据组织学确认的IDH1（R132H）+胶质瘤的第一个治疗阶段进行匹配（有或没有可测量的残留肿瘤后
，或部分切除或进行部分切除或活检），而没有1P/19Q共同缺失或肿瘤ATRX在肿瘤组织中的核ATRX表达丧失 ，以及WHO 3或4级或4级或4级或4级或4级的频率或4级元素或频率
，或者均等频率+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM+ CTM；表3）。没有使用统计方法来预先确定样本量
。样本量估计主要基于主要终点免疫反应（响应率）的准确性要求 到IDH1肽疫苗。调整了针对不可评估的患者的样本量 。据估计，在所有时间点都可以评估可评估免疫原性测试的患者中有70％
。由于有21名患者足以接受所有时间点的免疫原性测试 ，因此必须招募30名可评估的患者。由于预期的辍学率为20％（由于进展或其他原因）
，必须招募39名患者 。所有患者接受了与试验有关的干预措施；该试验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中没有关于试验有关的干预措施而蒙蔽
。 　　IDH1-VAC由300μg的IDH1（R132H）20-MER肽（P123-142）组成 ，由Tübingen，德国大学的GMP设施制造
，并在Montanide（ISA50）（ISA50）（如前所述）由GMP Core Hosport Germany hisidelberg的一大预付款，Anty Andy Andy Andy Andy Andy Andy Andy Gremany ，Andy Anderial of Montanide（ISA50）。它是与局部咪喹莫德（5％
，Aldara）结合使用的皮下给药 。在LS S.E.劳动力中，对每种乳液进行了含量 ，无菌性和缺失的质量控制
。＆Co。KG
，德国 。 　　主要终点是安全性和免疫原性
。安全端点是RLT，该RLT被定义为与IDH1-VAC管理有关的以下一个：国家癌症研究所不良事件的常见术语标准（CTCAE）4.0版4.0级4级；两周后持续存在的CTCAE 3级注射位点反应；至少CTCAE 3级的任何其他超敏反应 ，过敏反应或局部过敏反应；脑水肿（CTCAE 4级）;CTCAE 3级或以上的自身免疫性；CTCAE 3级或以上对骨髓以外的器官的毒性
，但不包括3级恶心，3级或4级呕吐的患者未接受抗emetic剂的最佳治疗 ，3级或4级腹泻的患者
，未接受抗diarheals的最佳治疗的患者，以及3级抗衡治疗；和死亡。如果治疗的关系是“一定的 ” ，“相关
”，“可能的”
，“可能的 ”或未报告的，则将不良事件视为治疗相关 。为了进行安全评估 ，每次访问时都会对患者进行医学检查。排除意外的IDH1-VAC诱导的针对IDH1（R132H）的免疫学耐受性
，无进展生存率（PFS）的缩短，定义为估计的12个月PFS速率的降低至少10％ ，至少10％的预期价值与先前的研究相比
，与先前的研究相比，预期为70.7％的预期率终止了安全性
。安全分析是基于所有接受过一个或多个IDH1-VAC给药的注册患者。免疫原性终点被定义为在试验过程中的任何时间点 ，都存在IDH1（R132H）特异性T细胞和/或抗体反应 。使用IFNγELISPOT和使用肽涂层的ELISA在PBMC上测量了IDH1（R132H）特异性T细胞和抗体反应
。对于IFNγELISPOT
，减去负对照后50个IFNγ斑点的截止被定义为阳性。对于Elisa， 阳性的临界值定义为与阴性对照≥5相关的光密度 。 　　根据中央神经放射学评论的RANO标准 ，使用标准化的三个月MRI进行了疾病评估
，包括总体反应率和PSPD的诊断
。在NOA16和分子匹配的对照组中，PSPD可能主要表明肿瘤内炎症反应24 ，定义为在T2-Flair MRI序列上的肿瘤大小和/或新颖出现或扩大的对比形成病变的新颖外观或扩大后，随后是稳定或重新进行了SOCINES MRIMI MRI和REPAINTION SOID和SOID的增强。 　　将冻干的肽在100％DMSO中重构
，并用Aqua AD Iniectabilia（Braun）稀释至10 mg ml -1 。最终的DMSO浓度为10％
。 　　在隔离之前，血清管保持直立在室温下15分钟。在室温下以1,000克离心10分钟 。将上清液在冰上等分 ，并在–80°C下冷冻
。 　　通过用磷酸盐 - 缓冲盐水（PBS）稀释后
，通过将生物体分离溶液（Biochrom）加载到生物胶体分离溶液（Biochrom）中，从密度梯度离心（在室温下无制动器）从神经胶质瘤患者中分离出PBMC ，并使用leucosep tubes（Greiner bio-hone）。将PBMC在50％冷冻培养基A（60％X-Vivo 20
，40％胎牛血清（FCS））和50％培养基B（80％FCS，20％DMSO）中冷冻 ，并在-140°C下存储在液氮中
，直到分析 。 　　将病变组织解剖成小块（2×2 mm），并将2 ml人类肿瘤淋巴细胞（TIL）培养基（rpmi1640（rpmi1640）（PAN BIBIOTEC）（pAN BIBIOTEC）中的2 ml人类肿瘤（TIL）培养的板以每孔为单位三片转移到24孔组织培养的板中（两个Gibco） ，1,000 U/ml IL-2（proleukin））
，其中包含30 ng/ml抗人类CD3（Clone Okt-3，Ebioscience）。每2至3天交换培养基 ，并在第7天去除组织碎片
。从肿瘤迁移到培养基中的小lil被进一步扩展到第14天，并如上所述冷冻保存。 　　为了实现LILS和TCR-转基因细胞的抗原特异性反应性的HLA自动测试
，患者自动 - 迅速扩展的PBMC（REP细胞）产生了高水平的MHC分子，并可以作为抗原呈递细胞（APC） 。将PBMC（1×105）与3×107的X-VIVO15培养基中的3×107辐射（40 Gy）进料细胞（来自非自动供体的PBMC）（来自非自动供体的PBMC）共培养 ，该培养基补充了2％人类AB（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）和30 ng/ML OKT-3 Anterbogen（invit-3 Antib）（intrabs）介质（SIGMA-ALDRICH）（SIGMA-ALDRICH）（SIGMA-ALDRICH）和25 M. bllasge in t-M.T-MECTOND（invit-3 Antib）（Invit-Mbolge）（Invitr）（Invitr）（Invitr）
。24小时后
，补充300 IU/mL HIL-2。每5天用补充HIL-2替换培养基，并根据需要分开细胞 。共同培养和冷冻保存14天后收集细胞
。 　　ELISPOT White Bottom MultiScreen HTS板（MSIPS4W10 ，Millipore）用抗人IFNγ（1-D1K
，MABTECH）覆盖，并用含有2％人白蛋白（HA）的X-Vivo-20（Lonza）封闭。将PBMC解冻 ，在X-Vivo培养基中休息过夜
，并以每孔4×105个细胞播种，并用100μl的体积用2μg肽刺激 。用IDH1（R132H）（p123-142） ，野生型IDH1（P123-142）或MOG（p35-55）刺激PBMC
，以相等的浓度或肽稀释液（p35-55），或肽稀释剂稀释剂含量（Braun）与10％DMSO（braun）的稀释剂（braun）在同等数量上或同等数量 ，或肠毒素B（Sigma-Aldrich）每孔和0.05μgCMV，每孔0.05μgADV（均为100μl体积）作为阳性对照
。40小时后
，用生物素化的抗人IFNγ抗体（7-B6-1），链霉亲和蛋白ALP（MABTECH）和ALP颜色发育缓冲液（Bio-RAD）检测到产生IFNγ的细胞 ，并使用免疫异种分析仪（Cellular Technology LTD）进行量化。质量控制是由第二人称进行和审查的 。对于T细胞反应的分类
，将瞬态T细胞响应定义为斑点计数高于50，其次计数在EOS时少于50
。持续的T细胞响应定义为超过50的斑点计数 ，其次计数超过50个EOS。 　　为了产生树突状细胞（DC）作为抗原呈递细胞
，在X-Vivo-20培养基中解冻自体患者PBMC，并以每mL的5×106细胞的密度铺在组织培养物处理的板上1小时 。除去上清液 ，并通过在含有500 U/mL HIL-4（Miltenyi）和560 U/ML人类粒细胞刺激性刺激性刺激因子（HGM-CSF）（HGM-CSF）（HGM-CSF）（HGM-CSF）（HGM-CSF）（GenZyme）中培养
，将粘附的单核细胞分化为DC。收集DC并使用磁性细胞分选（MAC）纯化
。抗CD56抗体与PAN小鼠IgG Dynabeads，CD19 Pan B Dynabeads和CD3 Dynabeads（所有Invitrogen）用于根据制造商的规程去除污染细胞群体。为了丰富抗原反应性T细胞的LIL ，DC在含有10％AB血清的RPMI1640培养基中以每ML的2×105细胞的密度播种
，100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素，并用10μg/ml IDH1（R132）（R132H）（R132 H）（R132 H）（P132） 。然后将它们与LIL共同培养 ，LIL已在X-Vivo-20培养基中解冻并过夜，以1：5的比例（DCS：LILS）
。对于T细胞的增殖
，从第3天开始，共培养培养基补充了40 U/ml IL-2（proleukin）和20 ng/ml IL-7（peprotech） ，并每2至4天刷新一次。共培养24天后收集LIL
，在RPMI1640培养基中休息过夜，其中含有10％AB血清 ，100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素
，用于ELISPOT，在共培养中与新隔离的自动dcs一起在共培养中 ，与上述自动dcs一起使用
，该DC与2μg/100 m11（r）一起使用 。（P123–142）或MOG肽（P35–55）作为阴性对照在同一培养基中过夜，以1：6（1×104 DCS：6×104 LILS）的比例为40 h
。如上所述进行ELISPOT。 　　对于外围免疫监测 ，用靶向表面蛋白的抗体染色3×105 PBMC：抗CD3-FITC（克隆UCHT1
，CAT＃300452，1：100） ，抗CD4-ALEXA-ALEXA FLUOR700（Clone RPA-T4，CAT＃300526
，1：1：1：1：1：100526，1：1：CLONE-ALEXA FLOOR700）RPA-T8 ，CAT＃301030
，1：100），抗CD11B-BV510（克隆M1/70 ，CAT＃101263
，1：20），抗HLA-DR-PE-CY7（克隆L243 ，CAT＃307616
，1：50），抗CD14-BV711（CLI CD14-BV711（CLONE M5E2 ，CAT）抗CD16-PE/DAZZLE594（克隆3G8
，CAT＃302054，1：10） ，抗CD25-BV605（克隆BC96，CAT＃302632
，1：20），抗CD33-APC（抗CD33-APC）（克隆P67.6A019D5 ，CAT＃351310
，1：20）（所有Biolegend）;以及可固定的生存力染料 - 欧洲780（1：1,000，Invitrogen） ，然后使用抗固定和许可缓冲液（Ebiosciencience）使用抗Foxp3-Pe（克隆206D
，CAT＃320108，1：100 ，Biolegend）进行细胞内染色 。先前滴定抗体量
。在所有实验中
，均使用相应的荧光减去一（FMO）对照（扩展数据图9）。使用Attune NXT软件2.7（Thermofisher Scientific）在Attune NXT流式细胞仪上测量了尽可能多的事件 。 　　为了分析IDH1（R132H） - 反应性T细胞子集，我们进行了一个离体肽召回测定法
。将PBMC解冻 ，在X-Vivo 20培养基中休息4小时
，并播种成96孔U底板。使用IDH1（R132H）（R132H）（P123-142），MOG（P35-55）用2μg肽刺激PBMC（1.5–2×106）作为阴性对照 ，或CEFT肽池（p35-55），或在3 h之前添加10°G/ML的CEFT肽池（p35-55）
，或者在0.05 µg/ml的阳性对照中添加阳性对照 。（Sigma-Aldrich，第B6542号订单）和1×Golgistop（BD Bioscience）。将细胞再孵育12小时 ，然后用以下表面抗体染色：抗CD3-BV510（克隆HIT3A
，CAT＃564713，1：20） ，抗CD4-BV605（克隆SK3
，CAT＃566908，1:50） ，抗Cd8-apc-apc-apc-h7（clone）1
，calte 117（callie）1，cat1919（calti）
。和2） ，抗CD25-BV711（克隆2A3
，CAT＃563159，1：10）和抗CD127-FITC（克隆HIL-7R-M21 ，CAT＃560549，1：2.5）以及可固定的染色性染色-APC-R700（1：1,000
，Invitrogen），然后用抗IFNγ-BV421（克隆4S.B3 ，CAT＃564791
，1：20，BD Biosciences）进行细胞内染色N49-653 ，CAT＃560486
，1：5）和抗IL4-PERCP-CY5.5（克隆8D4-8，CAT＃561234 ，1：20）（面板1）或抗foxp3-pe（克隆259d/c7
，clone 259d/c7，cy＃560046 ，1：560046
，1：5）和jesdi-iel10-cacc（capone-catone-catone-capcc（capone-catone-caccccccccccccccc）554707，1：50）（所有BD Biosciences） ，使用FOXP3/转录因子染色缓冲液集（Ebioscience）。抗体量先前滴定或根据制造商的说明使用，并根据播种时根据细胞数量进行缩放 。在所有实验中
，均使用相应的FMO对照（扩展数据图4）
。使用BD Facsuite Sotware版本1.3在歌词流式细胞仪（BD Bioscience）上测量了尽可能多的事件。 　　对于LILS的荧光激活细胞分选（FACS），将患者组织分为小块 ，转移到HBSS（Sigma Aldrich）中
，并通过100μm，70μm和40μm细胞滤器连续地通过HBSS间歇性洗涤来获得单细胞悬浮液 。用靶向表面蛋白的以下抗体染色：抗CD45-EFLUOR450（克隆2D1 ，CAT＃48-9459-42
，1：50，EBISOSCIENCE）和抗CD3-PE（Clone Hit3a ，Cat＃300308
，1:50，Biolegend）;和可固定的生存能力染料 - efluor780（1：1,000 ，Invitrogen）
。在带有FACSDIVA软件版本8.0（BD Biosciences）的FACSARIA IIU上
，将细胞门控为淋巴细胞，单细胞和活细胞 ，并将其分类为CD45+CD3+和CD45+CD3-细胞种群（扩展数据图12）。 　　为了在体内测试CD8+ LILS对IDH1（R132H）的反应性，在X-Vivo 15培养基中融化了从肿瘤碎片和患者特异性REP细胞扩展的冷冻保存的LIL
，其中包含50 U/ML苯并酶（Sigma Aldrich）（Sigma Aldrich），并在X-Vivo 15培养基中休息12 h- 2％人类（SIGMA ALDRICH） ，IU/ML HIL-2（Proleukin） 。将REP细胞辐照（30 Gy）
，在96孔U底板中以每个孔1×105细胞播种，并加载10μg/mL IDH1（R132H）（R132H）（P123-142）或MOG（P35-55）肽2 h
。同时 ，根据制造商的方案将LIL与CFSE（热泡）标记
，以帮助在流式细胞仪过程中区分它们，并以1：1的比例与肽加载的REP细胞共同培养。12小时后 ，将10μg/ml的Brefeldin A添加到共培养物中
，再加上5小时 。阳性对照细胞用20 ng/ml phorbol 12-羟on-乙酸13-乙酸盐（PMA）和1μg/ml离离子霉素（Sigma-Aldrich）刺激
。随后用以下表面抗体对细胞进行染色：抗CD3-BV510（克隆HIT3A，CAT＃564713 ，1：20
，BD Biosciences）和抗CD8-PERCP-CY5.5（克隆RPA-T8，CAT＃45-0088-42 ，1：1：100，ebiiccience）;以及可固定的染色性染色-Efluor780（1：1,000
，Invitrogen），然后用抗TNF-APC（克隆MAB11 ，CAT＃17-7349-82
，1：50）和抗IFNγ-Efluor450（Clone 4s.B3，CAT ，CAT＃48-73333319-42
，iCI），ifiNγ-efluor450（CLONE MAB11 ，CAT＃17-7349-82
，1：50）进行细胞内染色（CAT＃17-7349-82，1：50）缓冲套件（Ebioscience）。使用了相应的FMO控件（扩展数据图11） ，并在FACSDIVA软件版本9.0（BD Biosciences）上测量了FACSCANTO II流式细胞仪上的事件 。 　　所有实验的数据分析均使用FlowJo软件v.10.5.0进行。 　　将ELISA POLYSORP板（NUNC）与人IDH1（R132H）和人类野生型IDH1（P122-136和P123-142）一起涂覆
，用于患者IgG检测，以及阴性对照MOG（P35-55）（P35-55）（PBBS10μg）
。用PBS洗涤井0.05％Tween 20 ，并用PBS 0.05％Tween 20的3％FBS封闭。患者血清的阳性对照是用EBNA-1（raybiotech）（Raybiotech）（每个孔0.5 ng）的破伤风毒素（Millipore） 。通过离心从血清管中获得患者和健康对照血清
。以下稀释液使用患者血清：1：10
、1：100、1：333 、1：1,000和1：3,333。健康对照血清未稀释 。小鼠抗IDH1（R132H）（1：1,000，H09
，Dianova）用作肽涂料对照
。HRP偶联的二抗是绵羊抗小鼠IgG-HRP（1：5,000，Amersham）和山羊抗人IgG-FC-HRP（1：10,000 ，Bethyl Laboratories
，Inc。） 。底物是四甲基苯胺（EBISOSCIENCE），并用1 M H2SO4停止反应
。在450 nm处测量光密度。 　　根据制造商的说明 ，使用多重珠技术（Bio-plex Pro人类细胞因子27-plex面板
，M500KCAFOY，BIO-RAD ，HERCULES
，CA）分析血清 。血清稀释1：2
。通过使用套件中提供的参考细胞因子样品来生成标准曲线，并用于计算样品中的细胞因子浓度。获取和数据分析由Bio-Plex Manager进行 。 　　如前所述5。对于图像采集 ，将非线性调整（伽马变化）用于可视化目的
。 　　使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从患者EDTA血液中分离基因组DNA。根据制造商的方案
，对使用HSTCRB试剂盒（自适应生物技术）进行了TCRβ链（TCRB）深度测序，以检测使用HSTCRB试剂盒（自适应生物技术）的重排TCRβ基因序列 。德国癌症研究中心（DKFZ）的基因组学和蛋白质组学核心设施在Illumina Miseq上进行了测序
。使用自适应生物技术专有平台进行了数据处理（消除 ，修剪，基因映射）。使用Treemap可视化软件包2.4.2（https://cran.r-project.org/web/packages/treemap/index.html）可视化数据 。TCRB测序数据可在https://clients.adaptivebiotech.com/pub/platten-2021-nature中获得
。 　　使用QIAAMP DNA血液迷你试剂盒（Qiagen）从患者EDTA血液中分离基因组DNA。随后
，如前所述对肽结合结构域进行了测序25 。 　　如前所述进行850K甲基化阵列26
。 　　按照制造商的说明，在Promega Maxwell设备（Promega）上提取了FFPE组织的DNA。然后将提取的DNA剪切在Covaris M220（Covaris）上 。DNA完整性和片段大小是在生物分析仪2100（安捷伦）上确定的
。在NextSeq 500仪器（Illumina）上进行测序 ，平均覆盖率为550倍27。 　　根据制造商的协议
，使用铬单细胞V（D）J试剂盒V1化学（PN-1000006，PN-1000006 ，PN-1000006
，PN-1000005，PN-1000005 ，PN-12262）进行了FACS分类细胞的单细胞捕获和下游库结构 。分别在HISEQ2500 Rapid和Hiseq4000平台（Illumina）上对构建的SCVDJ库和SCGEX库进行了测序。 　　使用默认设置的CellRanger Pipeline（版本3.1.0）使用CellRanger Pipeline（版本3.1.0）（版本3.0.0
，10x基因组）处理单细胞RNA数据
。然后使用seurat28分析过滤后的矩阵。分析中排除了少于2,000个唯一分子标识符，少于900个基因和/或10％的线粒体基因表达的细胞 。排除在少于三个细胞中检测到的基因
。使用SCTRANSFORM29中实现的正则化负二项式回归对基因表达进行转化和标准化。将VDJ基因从可变基因中取出 ，以防止基于TCR克隆的细胞聚类 。使用主成分分析选择高度可变的基因
，并根据肘部图中的拐点选择40个主成分
。使用基于图的聚类将细胞聚类，Louvain模块化为0.45 ，并绘制UMAPS以进行可视化。使用MAST30进行差异基因表达分析，以确定每个簇的身份
，并使用高度上调的基因标记每个簇 。如上所述，排除了具有上调热激蛋白和CD3-细胞的簇 ，并将细胞重新归一化并重新簇
。使用CellRanger管道类似地处理了单细胞VDJ数据。然后将单个顶部TCR的条形码映射到单细胞RNA数据上
，以确定簇中TCR克隆的分布 。 　　单细胞测序数据已存放在NCBI序列读取存档中，并使用登录代码SRR12880623和SRR12880624沉积
。 　　TCR与BSAI介导的金门组件克隆兼容的TCR可变区域的合成α和βVDJ片段是从扭曲生物科学获得的。使用允许真核生物细胞中载体外复制的含S/MAR序列表达载体（PSMARTER） ，并设计用于掩盖小鼠α和β恒定的TCR区域以及P2A自换性肽链接器
，以促进TCR的单独alpha和Beta多肽链的产生 。使用单步金门反应将TCR变量片段插入表达载体中，并转化为NEB5-α竞争力的大肠杆菌（NEB）。通过抗生素耐药性筛选菌落以筛选转基因 ，并使用核对额外的最大EF试剂盒（Macherey-Nagel）进行转染制备无内毒素的质粒
。 　　克隆的TCR表达载体和基于纳米 - 卢西斯酶的NFAT报道载体（PDONR
，具有4×NFAT响应元件）被输送到Jurkatδ76细胞中（从TRON GGMBH中获得，使用多种型号和正常的司法验证的元素进行认证 ，并与正常的司法测试相比
，与正常的测试相比，电穿孔（霓虹灯转染系统 ，Thermofisher Scientific）。简而言之，每次电穿孔使用霓虹灯100μl尖端（8μgTCR表达载体
，带有5μgNFAT报告载体） 。根据制造商的规程制备细胞；用1,325 V，10 ms ，3脉冲电穿孔；并转移到含10％FC的无抗生素RPM1 1640培养基中
。患者自动自动PBMC或REP细胞被用作APC
，如指示并在X-Vivo 15培养基中的共培养前24小时被解冻，其中含有50 U/ml苯甲酶（Sigma-Aldrich） ，在6-8 h中静止6-8小时
，然后播种到96-透明的白色培养物中。最终浓度为10μg/ml的肽在150μl的总体积中持续16小时 。使用了人IDH1（R132H）肽（P122-136，P124–138 ，P126–140）的池
。MOG（p35–55）相等的浓度
，PBS + 10％DMSO（车辆）等体积的体积用作阴性对照。电穿孔后48小时，收集JurkatΔ76细胞并与肽负载的PBMC共同培养6小时 ，以1：1的比例 。人T细胞交易珠（Miltenyi）用作阳性对照
。根据制造商的方案（BMG LabTech）
，使用纳米GLO荧光素酶测定系统（Promega）测定了纳米 - 卢西酶诱导，表明TCR激活 ，使用纳米GLO荧光素酶测定系统（Promega）测定。 　　通过genscript合成肽并溶于DMSO，然后在测定缓冲液中稀释 。最终的DMSO浓度为10％
。肽不含半胱氨酸
，因此不添加还原剂。作为阳性对照，使用了肽夹（PVSKMRMATPLLMQA） ，KLAT（HA306–318
，YKYVKQNTLKLAT）或PADRE（AKFVAAWTLKAAA） 。在测定缓冲液（10,000
、1,000、100 、10
、1、0.1 、0.01和0.001 nm）中滴定肽，并添加了不同等位基因和旁系同源物的重组MHC II。至少24小时重折叠后 ，将溶液转移到αα受体中
，并添加供体珠
。将原始数据导入了Microsoft Excel并进行了反应。对于某些肽，最高浓度导致信号降低（钩效应） 。这些数据点已删除
。将数据导入GraphPad Prism软件9.0.0版本 ，并通过Sigmoid曲线拟合进行分析。所有实验均以良好的相关性重复进行 。 　　对于主要终点的统计分析
，定义了两个患者分析人群
。安全人群包括所有至少接受过一剂IDH1-VAC的入学率患者。这是用于评估患者特征，研究给药 ，功效（总反应率
，即稳定疾病）和安全终点（安全数据集，SDS）的分析数据集 。免疫原性种群（免疫原性数据集 ，IDS）包括所有可以评估免疫原性评估的患者
。如果患者完成了研究至少和包括V07的患者，则可以评估至少四次通过V07接种疫苗
，并且全部打算收集的血液样本，以通过V07进行免疫监测；或者至少接受了8次疫苗中的至少6个 ，基线加上至少有两个血液样本通过V12进行了免疫监测。除了由于RLT而提早离开研究的患者外
，不可用的患者被替换为评估免疫原性 。对于主要终点（RLT和免疫反应），根据Clopper -Pearson的汇总表 ，百分比和确切的95％CI
。 　　使用GraphPad Prism软件版本9.0.0使用探索性和描述性方法分析所有次要变量。对于PLA
，计算了Pearson相关系数 。对于应急分析，进行了Fisher的精确测试。为了进行多个比较 ，进行了按等级进行的Kruskal – Wallis检验（KWT）
，并提出了多重性调整后的P值（DUNN的测试）
。所有统计检验的两尾均为5％的显着性水平。有关探索性分析的详细描述，请参见补充表8 。有关选定的次要变量的分析 ，定义了分子数据集
。分子数据集包括所有可以根据拷贝数变化负荷（CNV-L）
，甲基化类别和CDKN2A/B状态回顾性地定义星形胶质细胞瘤的患者。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。