抗试剂抗体改善了PD-L1通过髓样细胞和Treg细胞的阻滞

　　从开放标签 ，随机相1b GO30103（NCT02794571）21和2期CityScape（ClinicalTrials.gov：NCT03563716）中获得的患者获得组织和外围样品 。这些试验方案得到了每个参与中心的机构审查委员会或道德委员会的批准，并遵守了良好的临床实践指南
，即赫尔辛基宣布的原则。在进行研究进入之前，要求患者将组织送到中央实验室 ，并在筛查时处理样品
。1B期研究中的患者每3周单独或与1,200 mg Atezolizumab进行了升级的替纪龙
，或者通过静脉注射剂量结合使用。City Scape用Tiragolumab与Atezolizumab评估了Atezolizumab，并在接受局部晚期或转移性NSCLC的化学疗法患者中与安慰剂一起评估了Atezolizumab 。患者接受安慰剂加1,200毫克的atezolizumab或600毫克Tiragolumab加上Atezolizumab每3周静脉注射1,200 mg ，直到疾病进展或失去临床益处
。协议批准是从每个参与站点的独立伦理委员会获得研究的
，并且一个独立的数据监测委员会审查了安全数据。患者结果的特征是反应（完全/部分反应）或无反应（稳定/进行性疾病） 。 　　从参加城市景观试验的患者中收集基线的肿瘤活检
。使用TRUSEQ RNA访问技术（Illumina）为N = 105例患者生成了全转录组轮廓。 　　在Ventana Discovery Ultra Autostainer上进行多重免疫荧光 。在与细胞调节（CC1）溶液（Ventana，950-124）中检索抗原后 ，将样品与抗foxp3兔单克隆抗体SP97（ABCAM; ABCAM; AB99963）
，抗PAN-CYTORKERTORKERATIN小鼠AE1/AE1/AE3（ABCAM，ABCAM ，AB278888）孵育SP251（Spring Bioscience
，M5510），抗PD-L1兔子单克隆SP263（Ventana ，790-4905），并用DAPI（Thermo Fisher Scientific
，D3106）对抗
。然后使用Ultistacker软件（Ultivue）对齐整个染色的幻灯片图像。 　　从C1D1和C2D1的城市景观的患者中收集血清样品 。根据制造商在Biogognosys在制造商的说明，使用与Dionex Ultimate 3000 RS泵（Thermo Fisher Scientific）连接到Dionex Ultimate 3000 RS泵（Thermo Fisher Scientific）的Agilent Mars Human-14多亲和度去除柱将样品耗尽了高丰度蛋白
。PQ500面板在每个样品中添加了参考肽（Biognosys）。 　　使用HRM/DIA方法加工了胰蛋白酶化的血清进行超反应监测（HRM）/数据无关的液相色谱和质谱测量测量（DIA）液相色谱 - 质谱测量测量 ，以及参考肽
，由一个完整的MS1扫描和29个MS2段组成，这些范围是先前的研究42 。 　　使用Spectronaut软件（Biognosys ，V.14.10）分析了HRM/DIA质谱数据
，并使用局部回归归一化43进行了归一化。使用光谱法（biognosys，v.2.5）搜索质谱数据 ，对肽水平和蛋白质水平的错误发现率设置为1％
。从DDA数据和直接数据数据中创建了两个单独的光谱库
，从HRM/DIA数据创建了两个单独的光谱库。根据Q值（截止值，0.01）过滤低质量的蛋白水平 ，并按照前面描述的作战校正了批处理效应 。44
。LIMMA45用于测试对数尺度蛋白水平的差异。PQ500测定面板数据用于临床功效分析 。通过平均所有显着增加的蛋白质（Marco
，CAMP，CD163 ，CSF-1R，CSF-1R
，CD5L，NGAL ，NGAL（LCN2）
，GAPR1，GAPR1 ，APOC1
，APOC1，APOC2 ，APOC2
，APOC3，APOC3和APOC4） ，在每个时间点（C1D1和C2D1）计算复合材料
。 　　R＆D系统中的人CD163免疫测定法（DC1630）有资格用于人类血清样品
，然后用来重复地测量患者血清样品的可溶性CD163。 　　从Tiragolumab Plus Atezolizumab（GO30103）的1B期NSCLC研究的患者中收集了PBMC 。共有16名患者来自C1D1，C1D15（治疗后2周） ，C2D1（治疗后3周）和C4D1（治疗后9周）可用样品
。将冷冻的PBMC解冻，在RPMI 2％FC中洗涤两次
，并用ACK裂解缓冲液（LONZA）处理以去除红细胞（RBC），并与DAPI短暂孵化。然后将300,000个细胞在DAPI阴性栅极上排序 ，在室温下染色30分钟
，定制面板为139个总seq-c抗体（Biolegend）46，并使用Immunai的HT1000层状洗涤系统（Curiox）洗涤3次 。然后使用Cellaca MX高通量自动细胞计数器（Nexcelom）对细胞进行计数 ，从五个样品中汇总
，并使用超载策略加载到10倍铬下一个GEM芯片G套件上
。使用人V（D）J T细胞富集富集TCR CDR3序列。根据制造商的协议（10倍基因组学）制备库，并使用S4 2×150 KIT（Illumina）在Novaseq 6000系统上进行了测序 。 　　C57BL/6J ，BALB/C和FCγR-KNOCKOUT小鼠购自杰克逊实验室。根据美国实验室动物护理指南
，所有小鼠均被安置在Genentech中
。小鼠被安置在维持在14 h – 10 h浅色周期下的动物室内的单独通风笼中。动物室是温度和湿度控制的，分别为68-79°F（20.0–26.1°C）和30–70％ ，每小时10至15室空气交换 。根据机构动物护理和使用委员会的指南
，任何具有大于2,000 mm5的肿瘤的小鼠都被安乐死
。所有实验动物研究均在Genentech Lab Animal Research的机构动物护理和使用委员会的批准下进行，并在评估和认证实验室动物护理认可的设施中进行。 　　如先前所述的15 ，生成了配体阻滞抗成分抗体克隆10a7，并将其克隆到小鼠IgG2a
，IgG2b和Fc int IgG2A-lalapg骨架上 。如先前所述生成单克隆小鼠PD-L1抗体6E11，并将其克隆到小鼠IgG2a-lalapg Fc fc无效骨链47中
。 　　CT26小鼠结肠癌细胞系来自美国型培养物。EO771细胞系来自CH3生物系统（SKU940001） 。在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养细胞 ，其中含有2 mM-谷氨酰胺和10％胎牛血清（Hyclone）
。在接种小鼠之前
，将细胞测试为不含支原体。对数相生长的细胞离心，用汉克平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次 ，对50％HBS和50％Matrigel（BD Biosciences）进行计数并重悬于 。总共将1×105 CT26细胞置于每只小鼠的右单侧侧面
。对于EO771肿瘤研究
，将1×105个EO771细胞注入了年龄匹配的6-8周龄C57BL/6雌鼠的第五个乳腺脂肪垫中。大约10-12天后，根据肿瘤大小 ，随机分为治疗组
，并用抗小鼠PD-L1（6E11，同型IgG2A lalapg ，10 mg
，每公斤10 mg）随机分为治疗组kg），抗小鼠CSF-1R（BioExcell ，BP0213，30 mg/kg）和/或抗GP120对照抗体（IgG2A同种型
，总计35 mg/kg总抗体剂量） 。对于EO771研究，使用抗GP120对照抗体（同种型IGG2A） ，抗小鼠PD-L1（6E11
，同种型，IgG2A lalapg）和抗小鼠Tigit（10A7 ，同种型
，IgG2A或同型IgG2A或同型IgG2A lalapg）用于10 mg Per kg。对第一个剂量静脉内给予抗小鼠PD-L1和抗小鼠Tigit抗体，然后腹膜内给予
。 　　在肿瘤生长抑制和巨噬细胞止血实验中 ，每周三次给药2周。第一个剂量静脉注射
，并通过腹膜内注射给予所有后续剂量 。连续监测动物，并在满足以下任何终点时通过窒息来安乐死：研究终止 ，肿瘤负担≥2,000mm3
，肿瘤溃疡，体重减轻≥20％或垂死外观
。使用卡梁测量肿瘤负担 ，并使用改良的椭圆形公式1/2×（长度×width2）计算肿瘤体积。在SCRNA-SEQ实验中，静脉注射一次抗体 。然后
，治疗后72小时，通过窒息对小鼠和CD45+细胞进行安乐死 ，进行SCRNA-SEQ分析
。在抗CSF-1R巨噬细胞止血实验中
，在抗体处理后72小时收集CD45+细胞进行SCRNA-SEQ分析，并在首次剂量的FACS分析抗体处理后的第7-20天收集。 　　将肿瘤切碎并用胶原酶/DNase消化 ，过滤并重悬于单细胞悬浮液中以进行FACS染色 。针对所指定的表面标记的荧光团偶联抗体被用来染色肿瘤和外周血细胞的单细胞溶液
。GP70四聚体染色后进行细胞表面染色。将细胞在冰上孵育20分钟
，并使用可为CD45，CD4 ，CD8
，CD8，CD11B ，CD11C
，MHCII，LY6G ，LY6C，LY6C
，LY6C，F4/80 ，CD86
，CD86，CD25和TIM3和TIM3和TIM3孵育20分钟 。对于细胞内染色 ，首先用表面标记染色
，固定，透化并用针对Foxp3 ，Tox
，TCF1或Ki-67的抗体染色
。对于细胞因子染色，用细胞刺激鸡尾酒加蛋白转运蛋白抑制剂（EBISOSCIENCE）刺激细胞3-4小时 ，用表面抗体染色
，固定，透化 ，用抗IFNγ和TNF抗体染色。除抗TOX（MILTENYI）和抗TCF1（细胞信号传导）抗体外，所有抗体均购自BD生物科学
，Biolegend或Ebioscience 。使用BD FACSymphony A5细胞分析仪流式细胞仪分析染色的细胞，并使用FlowJo软件进行了进一步的数据分析。 　　从小鼠中收集血液和肿瘤 ，并根据需要通过酶解离和/或红细胞裂解来处理单细胞悬浮液制备
。标记每个组织和治疗组中的细胞（Biolegend totalSeq C）
，从不同小鼠汇集，并用荧光抗CD45抗体和生存性染料标记。对实时CD45+细胞进行排序 ，并使用VI细胞XR细胞计数器（Beckman Coulter）确定细胞数 。根据10倍基因组学方案（CG000330_CHROMIUM NEXT GEM单细胞5-V2细胞表面蛋白USERGUIDE_REVA）处理总共20,000个CD45+细胞
，以生成5'单细胞RNA-SEQ和Hashed库
。在Novaseq S4测序仪（Illumina）上对两个库进行了测序，并具有基于10倍基因组学建议的规格 ，如下所示：5'单细胞RNA-Seq库以每个细胞的40,000读和Hashed库以每个细胞的2,000次读取（Abiosciences）进行了40,000个读数。 　　从CMV呈阳性的健康供体中分离人PBMC 。根据先前描述的方法
，用细胞因子处理PBMC，以将极化/分化为巨噬细胞48
。简而言之 ，对于M1巨噬细胞
，单核细胞用GM-CSF 50 ng ml-1处理3天，然后用IFNγ50ng ml-1与LPS 10 ng ml-1一起处理48 h；对于M2巨噬细胞 ，将单核细胞用M-CSF 50 ng ml-1处理3天，然后用IL-4 20 ng ml-1
，TGF-β50ng ML-1和IL-10 50 ng ml-1处理48小时。对于CD86，CD68 ，HLA-DR而言
，M1巨噬细胞高，但CD200R和CD163较低 ，而CD163和CD200R的M2巨噬细胞较高
，而HLA-DR的M2巨噬细胞较高 。将巨噬细胞用CMV肽（ANASPEC）和CEFX Ultrastim肽池（JPT肽）脉冲，并在Atezolizumab ，Tiragolumab
，Tiragolumab或Deglycosysyated Tiragolumab的情况下以5：1的比例引入来自同一供体的大量CD3+ T细胞
。在100 µg mL -1时，使用临床级Tiragolumab和atezolizumab。对于FC依赖性研究 ，使用100 µg mL-1的tiragolumab的退化形式使用 。所有试剂均无内毒素
。使用Luminex平台从上清液中进行IL-2和TNF的细胞因子测量。 　　使用Truseq RNA访问技术（Illumina）生成所有转录组轮廓 。进行RNA-Seq读取与核糖体RNA序列的比对以去除核糖体读数。然后使用NCI构建38人参考基因组使用GSNAP V.2013-10-10来对齐其余读取
，每75个基本序列最多两个不匹配（参数：-m 2 -n 10 -B 2 -B 2 -I 1 -N 1 -N 1 -W 200000 -w 200000 -e 1 -pairmax -rna = 200000 -cla = 200000 -clip -clip -over -lap）
。转录本注释基于Ensembl基因数据库（版本77）。为了量化基因表达水平，使用R包装基因组比对（生物导体）50的功能以链特异性方式计算映射到每个RefSeq基因外显子的读数数 。 　　人类肺肿瘤的SCRNA-SEQ数据集报道了以前51个从E-MTAB-6149获得的
。根据标准工作流（Seurat）53 ，将数据转换为Seurat对象，并使用Seurat R软件包（v.3.2.2）进行分析。检索并分析髓样细胞以定义细胞亚型 。如前报道
，如果有任何一个 <201 unique molecular identifiers (UMIs), >6,000或 <101 expressed genes, or >10％来自线粒体基因组的UMIS
。使用默认参数的归一化函数对过滤的基因表达矩阵进行标准化。然后，我们缩放了数据 ，并回归了UMI计数变化的影响和线粒体含量百分比（Scaledata） 。主成分分析是在缩放的缩放数据上对带有默认参数的FindVariableFeatures定义的前2,000个可变基因进行的
。为了集成不同的样本
，使用Harmony（V.1.0）软件包54，并将前20个主组件（PC）用作默认参数的Runharmony函数的输入。使用FindClusters使用0.5分辨率定义细胞簇 ，并使用先前策划的规范标记基因注释55 。 　　基因特征源自这些NSCLC SCRNA-SEQ数据集51,56
，或者先前已描述为57,58
。为了得出TAM特征，通过将特定髓样细胞簇中的细胞与其他每个簇中的细胞进行比较 ，以成对的方式定义了每个髓样簇的标记。为了保证标记物的髓样特异性表达
，我们仅保留了在独立的数据集56（包括基质，肿瘤和非乳突膜免疫细胞）中未由非乳突细胞表达的标记基因 。我们对三个先前描述的巨噬细胞种群进行了分组55 ，其特征在于其免疫抑制特性为TAM。我们结合了每个定义的巨噬细胞簇的签名基因
，并得出了结果签名（Marco，ACP5 ，VSIG4，MRC1
，MSR1，MCEMP1 ，MCEMP1
，CYP27A1，OLR1 ，GRN
，GRN，GLIPR2 ，ARRDC4
，ARRDC4，C1QC ，C1QC
，APOE，APOE ，FOL2，FOLR2
，CTSD和SPP1）
。 　　将SCRNA-SEQ读数与人体转录组对齐（GRCH38），并量化了UMI计数以使用细胞Ranger Pipeline（10x Genomics ，v.5.0.1）生成基因– Barcode矩阵。使用细胞游舱管道（10x Genomics
，v.5.0.1）生成Cite-Seq抗体表达矩阵 。将TCR读取与GRCH38参考基因组对齐，并使用Cell Ranger VDJ管道（10x Genomics ，v.5.0.1）进行共识TCR注释
。为了将细胞分配到各自的原点样本中
，将细胞用Seurat封装的修改后的Htodemux函数取消，从而通过最小的非零表达来定义负簇。 　　通过细胞游侠管道产生的预处理基因表达基质将导入到Seurat（V.3.2.2）中进行下游分析 。作为一个质量控制步骤 ，去除少于十个细胞中表达的基因并根据检测到的基因的数量
，检测到的UMIS的数量，家居保存基因表达和线粒体基因表达的百分比过滤细胞
。除去少于十个家具基因的细胞被去除。对于UMIS ，检测到的基因和线粒体基因表达
，截止值定义为更保守的预定义的截止值（UMIS：下部：下部，1,000；上 ，20,000；基因：下，200;上
，5,000;上，5,000;线粒体基因表达 ，10％）和使用Internetermenterquartilesementsemess ranges rangess comported计算 。此外
，使用自动过滤算法去除RBC和血小板污染物
。使用标准化函数（标准化。Method=“ lognormalize ”和scale.factor = 10,000），将过滤的基因表达矩阵（17,804个基因×406,296个细胞）进行标准化 。使用中心gog比例法对表面蛋白进行标准化
。使用默认参数使用FindVariable Features函数鉴定可变基因。在降低维度之前 ，将数据缩放
，并将UMI计数变化和线粒体含量百分比的变化效果（缩放质函数）回归 。然后，对切割到可变基因的缩放数据进行了主成分分析。使用Harmony（V.1.0）软件包54来减轻批处理效应
。计算共享最近的邻居 ，然后使用图形社区聚类方法聚类。使用RunuMap函数生成UMAP 。考虑RNA
，表面蛋白和TCR序列，使用细胞类型分类器注释细胞 ， 并通过使用Immunai精心策划的内部签名来进一步验证和完善
。多矩数据进一步用于去除低质量的细胞和先前未检测到的双线仪（例如
，同时表达CD8和CD4蛋白质标签的细胞，以及表达高B细胞签名并具有检测到的TCR的细胞）。 　　为了从SCRNA-SEQ数据中鉴定出增殖的细胞 ，使用SEURAT的细胞验函数计算了S和G2M相处的细胞增殖分数 。基于G2M相得分≥0.22或S相得分≥0.22，称为增殖细胞
。 　　通过伪膨胀分析进行差异基因表达（DEG）测试
，其中每种样品和细胞类型汇总基因计数（求和）。除去少于10个细胞的每个细胞类型的样品被去除 。使用Limma-Voom R软件包（v.3.44.3）45对每种单元类型独立进行差异表达分析
。添加了患者ID作为设计公式的协变量，以考虑配对设计。取消了没有匹配前和治疗样品的患者 。Limma DEG测试的调节t统计量用作途径富集分析的预先基因列表输入 ，该输入使用FGSEA R软件包（v.1.14.0）59进行
。在此分析中
，我们使用了从MSIGDB收集的标志基因集（V.7.2）。 　　将基因表达FASTQ文件对齐与小鼠转录组（MM10），并使用细胞游舱管道（10x Genomics ，v.6.1.1）来量化UMI计数以生成基因– Barcode矩阵 。使用Cell Ranger Pipeline（10x Genomics
，v.6.1.1）生成抗体衍生的TAG（ADT）表达式FASTQ文件。将导出的基因表达和ADT表达矩阵进口到Seurat封装中以进行下游分析
。用中心的对数比转换将ADT数据归一化，并使用HtoDemux函数为每个单重线单元格分配原始鼠标 ，并注释双重函数和单元。 　　如上所述
，生成三批小鼠SCRNA-SEQ数据并根据标准Seurat工作流进行分别分析 。在整个分析过程中，我们确认了样品或其他技术因素引入的批处理效应 ，因此在我们的数据中没有执行批处理效应
。与其他细胞相比
，簇中的典型标记基因和高表达标记基因注释细胞。 　　具体而言，对于用同种型对照治疗的小鼠产生的SCRNA-SEQ数据 ，抗象征 - lalapg，抗tigit-igG2b和抗tigit-igG2a抗体
，单细胞和阴性细胞用于下游分析 。从外周血中收集的细胞使用以下过滤保持：线粒体％计数<5％，1,000 <UMI计数<15,000和500 <基因计数<3,500 ，总共26,174个细胞
。前25个PC和1分辨率用于降低降低和聚类
，并将具有相似标记基因表达的簇组合在一起。使用以下过滤保留从肿瘤中收集的细胞：线粒体％计数<5％，1,000 <UMI计数<25,000 <25,000和500 <基因计数<6,000 。我们首先使用前25个PC来降低维度 ，并以0.6分辨率聚集所有细胞
，以定义较宽的髓样细胞（n = 5,352）和T/NK淋巴细胞（n = 21,407）
。对髓样细胞（前20个PC和0.9分辨率）和T/NK淋巴细胞（前23个PC和0.9分辨率）进行了进一步的聚类分析。 　　对于用同种型控制处理的小鼠，抗PD-L1 ，抗tigit-igG2b和抗tigit-igG2A
，抗PD-L1+抗tigit-igG2b和抗PD-L1+抗PD-L1+抗tigigit-igg2a抗体的抗tigit-igg2a和抗tigit-igg2a，用于下降分析 。使用以下过滤保持从外周血中收集的细胞：线粒体％计数<5％ ，1,000 <UMI计数<20,000 <20,000和500 <基因计数<4,500
，总共有55,368个细胞
。前25个PC和1分辨率用于降低降低和聚类，并将具有相似标记基因表达的簇组合在一起。使用以下过滤保留从肿瘤中收集的细胞：线粒体％计数<5％ ，1,000 <UMI计数<25,000 <25,000和500 <基因计数<6,000 。我们首先使用前25个PC来降低维度，并以0.1分辨率聚集所有细胞
，以定义较宽的髓样细胞（n = 4,261）和T/NK淋巴细胞（n = 35,358）。在髓样细胞（前20个PC和0.9分辨率）和T/NK淋巴细胞（前20个PC和0.6分辨率）上进行了进一步的聚类分析
。 　　对于用同种型对照的小鼠产生的SCRNA-SEQ数据，抗PD-L1+抗tigit-igG2A和抗PD-L1+抗tigit-igG2A+抗CSF-1R抗体 ，SINGLETS用于下游分析。使用以下过滤保留从肿瘤中收集的细胞：线粒体％计数<5％
，1,000 <UMI计数<25,000 <25,000和500 <基因计数<6,000 。我们首先使用前20个PC来降低维度，并以0.6分辨率聚集所有细胞 ，以定义较宽的髓样细胞（n = 3,734）和T/NK淋巴细胞（n = 21,575）
。在髓样细胞（前20个PC和0.6分辨率）和T/NK淋巴细胞（前25个PC和0.6分辨率）上进行了进一步的聚类分析。 　　使用在Seurat中实施的两尾Wilcoxon Rank-SUM测试进行差异基因表达分析 。Findmarkers函数用于定义每个治疗组细胞之间的DEG
。火山图和气泡图用于可视化每个治疗组中差异表达的基因。 　　使用Kaplan -Meier方法分析了生存结果
，OS和PFS 。实施单变量COX回归以估计HR和95％的顺式
。实验的统计详细信息，进行的重复次数以及所使用的统计测试的数量如图和方法所示。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。