胞质监视机制激活线粒体UPR

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见 。 　　除非另有说明 ，否则将使用美国型培养物收容的HeLa卵巢癌细胞用于所有实验。它们被确认为支原体阴性，并在RPMI培养基（Thermo Fisher Scientific）和10％胎牛血清中生长
。根据制造商的说明
，用Lipofectamine rnaimax进行了敲低实验。使用的小型干扰RNA（siRNA）来自Origene Oligo Duplex ATF5（SR307793），并为LONP1定制（sance 5'-Ggacguccugcugcuggcuggaagagaccaauauau-3' ，抗sane-aauuggugugugucucuccaggagagaggacgacgacgacgacgucc） 。Esirna任务（Sigma）为ATF5（EHU039491）
，DNAJA1（EHU114481），HSF1（EHU107721） ，DNAJA2（EHU005311）
，DNAJB1，DNAJB1（EHU109151） ，NRF1（NRF1（EHU0699871）和PITRM 1（EHU109151）和PITRM
。基因KO是通过CRISPR-CAS9介导的基因组编辑进行的。将单个引导RNA（SGRNA）克隆到ESPCAS9中（1.1； Addgene
，目录编号71814） 。使用的SGRNA序列为5'-GCAACAGAAAGTCGTCAACA-3'（HSF1），5'-TCTCTTCTTAGATGATTACCTGG-3'（ATF4） ，TCAGCCCACAAGCCAAGCAGAGAAGCA-3'5'-TGGCTCCCTATGAGGTCCTT-3'（ATF5_1）和5'-agactatgggaaactgaAactccccccc-3'（ATF5_2）
。与含SGRNA的质粒一起
，用抗嘌呤霉素的质粒共转染细胞，并用1μgml-1紫霉素（Invivogen）选择24小时。选择后 ，将单个细胞接种到96孔板中，并孵育2周 。扩展了所得菌落
，并通过Sanger测序和Western印迹证实了Gene KO
。 　　根据制造商的指示，使用Lipofectamine 2000进行了MTS-ABETA-GFP的短暂过表达。24小时后收获细胞 。 　　用10 µM GTPP（上海化学药品） ，5 µM CDDO（Cayman Chemical）和40 µM UCF-101（Cayman Chemical）（Cayman Chemical）（除非另有说明）（另外说明早期响应
，使用3 h孵化），用10 µM GTPP（上海化学）和40 µM CDDO（Cayman Chemical）和40 µM UCF-101（Cayman Chemical）进行急性诱导
。对于细胞活力测定 ，应用了15 µM GTPP的毒性浓度16小时（扩展数据图9d – f）。MTROS诱导是通过用10 µM抗霉素A（Sigma）或2 µM鱼藤酮（Sigma）处理细胞进行6小时来完成的 。为了清除ROS
，将细胞用10 mM NAC（Sigma）或10 mM GSH（Cayman Chemical）预处理1 h或100 µm Mntbap（Sigma）过夜，以持续为旋转。对于超7参考 ，使用了20 µm抗霉素A和1 mM H2O2（Carl Roth）
。4,4'diisothiocyanatostilbene-2,2'-二硫酸酯（75 µm
，Sigma）用于抑制VDAC1 6小时。用35 µm CHX处理30分钟，将一般翻译阻塞 ，并继续作为共同处理6小时 。用5 µM寡霉素A（Sigma）进行线粒体进口抑制6小时
。用10 µM氰化物M-氯苯基氢援酮（CCCP
，ABCAM），100 µM推feriprone（DFP ，Sigma）或10 µM Menadione（Sigma）处理，通过6小时的治疗使用6小时的治疗施加不同的线粒体应激源。通过在BD Gaspak EZ Pouch System（BD诊断）中孵育细胞来产生低氧状况6小时 。用星形孢菌素（Cayman Chemical）用于在1 µm下以1 µm的对照处理诱导凋亡
，3 h或200 nm过夜，用于HSF1 KO细胞生存能力测定法（扩展数据图9D – F）
。 　　对于构建体MTS-ABETA-GFP的生成 ，将PCDNA5/FRT/TO（Thermo）用作骨架。通过Q5高保真DNA聚合酶（NEB）扩增以下插入片段
，并通过雾化器HIFI HIFI DNA组装大师组合（NEB）克隆到主链中：MTS（2×Cox8 presequence in-pcmv cepia2mt cepia2mt（添加GATE）catalog，catalog ，catalog
，catalog，58218（abte a abta）2（cox8 presequence） 。用引物（5'-TCC ATG CGG GGT TCT GAT GCA GCA GAA TTC CGA CGA CAT GAC TCA GGA TAT G-3'和5'-CTC GCC GCC CTT GCC CAC GGA CAC GGA TCC CGC CGC CGC tat GAC ACC CAC CAC CAC C-3 ang flumention and link从HELA野生型互补DNA（cDNA）放大
。（EGFP）从SU9-EGFP放大（Addgene ，CatalogNo。23214） 。 　　按照制造商的说明
，使用核素素RNA Plus试剂盒（Macherey-Nagel）从细胞中提取总RNA，然后用Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific）消化
。如先前所述 ，进行了poly（a）-RNA的批量测序的库准备31。简而言之
，使用含有条形码的寡-DT引物，独特的分子标识符（UMIS）和适配器 ，使用最大值RT聚合酶（Thermo Fisher Scientific）生成每个样品的条形码cDNA 。通过模板开关寡核扩展了cDNA的末端，并用结合到模板开关寡核位点和适配器的引物扩增全长cDNA。NEB Ultraii FS试剂盒用于碎片cDNA
。末端修复和尾巴后
，将TRUSEQ适配器连接，并使用具有Illumina P5和P7悬垂的引物进行3'端片段。与Parekh等人31相比 ，交换了P5和P7位点
，以允许在Read1和Read2中的barcodes和barcodes和umis在Read2中进行测序，以获得更好的群集识别 。该库是在NextSeq 500（Illumina）上测序的 ，在Read1中为cDNA进行了63个循环
，在Read2中为条形码和UMIS进行了16个周期
。 　　Gencode基因注释V.35和人参考基因组GRCH38源自Gencode主页（欧洲分子生物学的欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI））。Drop-seq工具（V.1.12）32用于将原始测序数据映射到参考基因组 。将所得的UMI过滤计数矩阵导入R（V.4.0.5），然后将低表达的基因滤出
。然后通过在DESEQ2（v.1.18.1）33中实现的RLOG函数稳定数据。为了进行准确的分散估计 ，为功能提供了实验设计（在给定时间点的处理） 。RLOG归一化数据用于使用R软件包Mfuzz（V.2.50.0）34进行聚类分析（模糊C平均值）
。分析中排除了少于三个的RLOG归一化值的转录本。集群的数量设置为三个 。对于每个集群的群集成员资格大于或等于0.8
，将成绩单分配给了集群组增加和减少
。通过使用数据库进行注释，可视化和集成发现（David） ，对每个群集组进行了基因本体（GO）富集分析。使用Cytoscape（v.3.7.1）中的富集图（v.3.3.2）插件可视化GO富集 。 　　按照制造商的说明
，使用核素素RNA Plus试剂盒（Macherey-Nagel）从细胞中提取总RNA。使用高容量性cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行cDNA合成
。根据制造商的说明，使用Primaquant Sybrgreen Master Mix（Steinbrenner Laborsysteme）进行定量聚合酶链反应（QPCR）分析。Sigma的Kicqstart Primers Sybr Green（补充表4）用于以384-Well格式使用LightCycler 480 SW（v.1.5）进行QPCR测量 。ACTB用作内部控制
。使用比较CTΔΔCT（循环阈值）方法计算转录水平的倍数变化。 　　Mitosox Red（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的说明来测量MTROS的生产 。根据制造商的说明 ，通过与Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）和碘化丙酰基科学丙啶（Thermo Fisher Scientific）结合结合的膜联蛋白V的结合来测量细胞死亡
。在FACSCANTO II和FACSYMPHONY A5流式细胞仪系统（BD）上，对荧光激活的细胞分选（FACS）分别对Mitosox和Annexin v Measurentes进行FACSDIVA（v.6.1.3）进行。FAWJO v.10软件对FACS数据进行分析 。 　　将细胞裂解在RIPA缓冲液中
，其中含有完整的无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche）和天才核酸酶（Santa Cruz Biotechnology）
。在1×Laemmli缓冲液中制备裂解液，并在95°C煮沸10分钟。使用Invitrogen NOVEX系统将蛋白质用SDS-PAGE分离 ，并使用Mini Trans-blot细胞（Bio-Rad）转移至硝酸纤维素膜 。在室温（RT）下将一抗在免疫印迹中添加1小时
。Antibodies used for the detection were anti-ACTB (SantaCruz, catalogue no. sc69879, 1:4,000), anti-HSPD1 (Abcam, catalogue no. ab46798, 1:2,000), anti-COX5B (Proteintech, catalogue no. 11418-2-AP, 1:1,000), anti-HSF1 (Cell Signaling, catalogue no.4356
，1：1,000），抗HSF1（ABCAM ，目录号AB2923
，1：10,000），抗DNAJA1（ProteIntech ，CatalogNo。11713-1-AP
，1：2,000），1：2,000） ，抗HSP70（proteeintech
，ProteeIntech，Catalogno 。109995-1-AP ，1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2,000）（D9K6P），目录编号46743
，1：1,000），抗α-微管蛋白（细胞信号（DM1A） ，目录号3873
，1：3,000），抗内酮H3（主动图案反茶商（Thermo Fisher Scientific ，Catalog No。MA1-250
，1：1,000），抗ATF4（电池信号传导 ，目录编号11815
，1：1,000），抗PITRM1（Novus ，Catalog No.H400010531-M03
，1：1：500），Anti-lonp1（potti no.1：ProteeTech ，catalIntech，catalog catalig catalog catalog catalog catalog catalog
。抗切断的PARP1（细胞信号传导
，目录号5625，1：2,000）和抗Caspase3（细胞信号传导 ，目录号9661
，1：1,000）。Secondary antibodies used were anti-rabbit IgG (H + L) HRP Conjugate (Promega, catalogue no. W4021, 1:10,000), IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG (H + L; Li-Cor, catalogue no. 926–32211, 1:15,000) and IRDye 680RD donkey anti-mouse IgG (H + L;Li-Cor，目录号926–68072 ，1：15,000） 。适当的二级抗体用于使用Odyssey DLX（LI-COR）或Chemidoc MP（Bio-Rad）成像系统进行成像
。用图像工作室（V.5.2）或Imagelab V.6.0.1收集数据。 　　如前所述制备线粒体级分35 。简而言之
，通过在含有10 mM HEPES（pH 7.4），50 mM蔗糖 ，0.4 m甘露醇
，10 mM KCl和1 mM EGTA的缓冲液中穿过27尺寸的针头注射器来匀浆细胞
。用两步的差速器以1,000克的速度进行线粒体富集，然后在4°C下每人15分钟。将富含线粒体的颗粒重悬于含有20 mM HEPES（pH 7.4） ，0.4 m甘露醇
，10 mM NAH2PO4和0.5 M EGTA的缓冲液中 。添加了含有2％（Vol/vol）NP40的相等体积的裂解缓冲液，并向下旋转至单独的线粒体分数
。将所得的上清液和颗粒分别保存为可溶性和不溶性分数。用1x Laemmli缓冲液中的SDS -PAGE分辨蛋白质 ，并用Instantblue Coomassie染色（Expedon）可视化 。 　　用REAP方法将细胞分馏36
。通过在含有0.1％NP40的PBS中重悬于PBS中，制备细胞级分
，然后用P1000微管（Gilson）重悬于5倍的五倍。用“流行自旋”在Eppendorf桌面微型器中用“流行自旋 ”在4°C下用“流行旋转” 10 s分馏 。将上清液作为胞质分数收集。用0.1％（Vol/vol）NP40洗涤颗粒一次，并收集为核分数
。细胞质和核部分均用于进行免疫印迹。核与胞质HSF1的比率如下： 　　HSF1（N/C）=（核HSF1/组蛋白H3）/（细胞质HSF1/微管蛋白） 。 　　通过在含有0.8 mg ml -1二硫代抗体[丙酰丙酰亚胺]（proteochem）的PBS中孵育细胞 ，在RT37时孵育30分钟
，进行交联
。将含有200 µM甘氨酸的PBS淬灭RT时淬灭15分钟。将细胞在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液（50 mM Tris（pH 8.0），150 mM NaCl ，1％（Vol/vol）NP40）中裂解
，并在4°C下孵育30分钟 。使用含有2 mg总蛋白质的裂解物用10 µL Dynabeads蛋白A（Thermo Fischer Scientific）进行免疫沉淀，其中含有1 µg合适的抗体或10 µL抗FLAG M2磁珠（SIGMA）在4°C下2 h
。从珠子中洗脱免疫沉淀的蛋白质以进行免疫印迹或消化以进行相互作用蛋白质组学。 　　对于氧化还原蛋白质组学 ，将细胞在HES缓冲液（1 mM EDTA
，0.1％（wt/vol）SDS，50 mM HEPES（pH 8.0））中含有蛋白酶抑制剂和10％（VOL/vol/vol）TCA ，并在4°C下孵育2小时 。将每个样品分为两个分数：（1）氧化的Cys级分和（2）总CYS部分
。用TCA和丙酮沉淀沉淀蛋白质。对于馏分2
，将100 µg的蛋白质重悬于HES缓冲液中，补充了5 mM TCEP ，并在50°C下孵育1小时，以减少所有Cys硫醇 。对于馏分1
，将100 µg的蛋白质重悬于变性缓冲液中（6 m尿素，1％（wt/vol）辛基β-葡萄吡喃糖苷 ，50 mM HEPES（pH 8.0））
，并补充了蛋白酶抑制剂和200 mm碘甲酰胺，并在37°C中孵化1 H bock cous Cys Cys cous cous cous cous cous cous cous cous cous in 37°c bockior bockior coss
。如前所述 ，氧化的Cys硫醇被降低
，如先前所述2。通过TCA和丙酮沉淀清洁蛋白质 。为了标记游离的Cys硫醇，将蛋白重悬于变性的缓冲液中 ，补充了iodotmt＃1（Thermo Fisher Scientific）的分数1或iodotmt＃2用于分数2
，并在黑暗中在37°C下在37°C下孵育1 h。用20 mM DTT淬灭标记反应
。将标记的蛋白质合并在一起，并用TCA和丙酮沉淀清洁。用1:50（wt/wt）的LYSC（WAKO化学品）和1：100（wt/wt）胰蛋白酶（Promega）在10 mM EPP（pH 8.2）中消化蛋白质 ，在37°C下过夜 。用（50毫克）Seppak柱（水）纯化肽
，然后干燥
。根据制造商的说明，将iodotmt标记的肽富含抗TMT抗体树脂（Thermo Fisher Scientific）富含。按照制造商的说明 ，将富集的标记肽池进行了高pH反相分级（Thermo Fisher Scientific） 。将分馏的肽串联成四个单独的部分
。 　　为了执行相互作用蛋白质组学，在免疫沉淀步骤25 µL SDC（2％SDC（WT/Vol）
，1 mM TCEP，4 mM氯乙酰酰胺 ，50 mM Tris（pH 8.5））后
，将其添加到珠子中。将混合物加热至95°C，并收集上清液 。对于消化 ，含有1:50（wt/wt）LYSC（Wako Chemicals）和1：100（wt/wt）胰蛋白酶（promega）的50 mM Tris（pH 8.5）
，并添加1：100（wt/wt），并允许在37°C下孵育过夜
。通过添加含有1％（Vol/vol）TFA的150 µL异丙醇来停止消化。用SDB-RPS（Sigma）进行肽纯化 ，然后干燥 。 　　将肽重悬于2％（体积/体积）乙腈/1％（体积/体积）甲酸溶液中
，并在易于NLC 1200（Thermo Fisher Scientific）和35厘米长的75-cm长75μm-inner-Inner-Inner-Inner-Inner-Inner-inner-Inner-inner-Diameter Fused-silica柱上分开，使用了1.9-m C18颗粒量的储存量 ，该柱在HOUSE中挤满了50 cemir-c18 pressir-c18颗粒
。集成的圆柱烤箱（儿子）。对于氧化还原蛋白质组
，在90分钟内通过非线性梯度从4至36％（体积/体积）乙腈洗脱肽，并直接喷入配备2.3 kV的QEXACTACTIVE HF质谱仪中 ，配备了纳米Fisher Scientific（Thermo Fisher Scientific） 。以120,000的分辨率在m/z 200的分辨率下，最大注射时间为25毫秒和自动增益控制（AGC）目标值为3×106。最多20个最强烈的肽的最大注射时间（AGC）
，使用1个最高的肽使用1-较高的窗口来隔离较高的核电（3范围）（使用较高的汇总（3范围），以3×106的分辨率（350–1,400 m/z） ，最大注射时间为3×106
。使用较高的分流（均衡）（3范围内）
，将每次全部完全扫描均隔离。MS/MS光谱以M/Z 200的分辨率为45,000，最大注射时间为86 ms ，AGC目标值为1×105 。具有1、5至8和8的电荷状态
，以及无压力状态的离子的电荷状态不被视为分裂
。将动态排除设置为20 s，以最大程度地减少已经获得的前体的重复测序。 　　对于相互作用蛋白质组学 ，非线性梯度在60分钟内从3.2至32％的非线性梯度洗脱
，然后在6分钟内逐步增加到95％B，在2.3 kv的喷雾伏特（Praper Foltage）中 ，将其静置9分钟
，并将其喷入Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质量光谱仪（Thermo Fisher科学） 。以60,000的分辨率在m/z 200，最大注射时间为50毫秒 ，AGC目标值为4×105，以60,000的分辨率为60,000
，最大的注射时间为4×105
。最强烈的前体，最高的前体态度最高的前体 ，选择了2和6的全部全部扫描（使用1.5 s的高速度分配）
，则选择了2和6的AGC目标值（35500 m/z）。30） 。MS/MS光谱以M/z 200的15,000分辨率获得，最大注射时间为22 ms ，AGC目标值为1×105
。具有一个和六个以上的电荷状态的离子以及未分配电荷状态的离子的离子不被考虑用于碎片。将动态排除设置为45 s
，以最大程度地减少已经获得的前体的重复测序 。 　　为了分析氧化还原蛋白质组学数据，使用蛋白质组发现者2.4软件（Thermo Fisher Scientific）分析了原始文件
。使用默认设置和使用proteome Discover中的sequestht节点执行的默认设置和数据库搜索选择了光谱。针对用于质量控制的普通污染物（contaminant.fasta'）的swissprot数据库和Fasta文件进行数据库搜索 。在半胱氨酸残基上 ，动态修饰设置为蛋氨酸氧化（C
，+15.995 DA），iodotmt6plex（C ，+329.227 DA）和氨基甲米甲基（C
，+57.021 DA）。设置了一个搜索节点，以搜索MET损耗+乙酰基（M ，-89.030 DA）作为N末端的动态修改
。使用sequest HT进行搜索。每次搜索后，都会计算后验错误概率
，并使用具有默认设置的Percolator过滤肽光谱匹配 。使用默认设置执行记者离子量化的共识工作流，只是将最小信噪比设置为10
。然后将结果导出到Excel文件以进行进一步处理。非范围的丰度用于定量 。每种肽的半胱氨酸氧化百分比的计算如下： 　　氧化cys的百分比=（分数的丰度1/分数的丰度2）×100％
。 　　对于具有几种不同CYS修饰的肽 ，考虑了每种不同组合的氧化Cys百分比的倍数变化。 　　对于DNAJA1相互作用蛋白质组学
，使用MaxQuant（V.1.6.17.0）及其无构建标签的无标签定量算法MaxlFQ进行应用默认参数38进行MS原始数据处理 。使用从Uniprot（12-03-2020;“每个基因的一个序列
”，20,531个序列）和一系列常见污染物（244个条目）下载的人类参考蛋白组（分类识别9606）搜索获得的光谱
。对肽光谱匹配（最小长度为7个氨基酸）和蛋白质的识别率进行过滤以获得低于1％的错误发现率 ，并使用目标销售策略40。然后将结果导出到Excel文件以进行进一步处理 。将丰富的相互作用者归一化为每个样品中DNAJA1的丰度
。折叠的变化是根据归一化数据计算得出的。使用David进行了DNAJA1 Interactome的GO富集分析 。使用Cytoscape（v.3.7.1）中的富集图（v.3.3.2）插件可视化GO富集。从Uniprot手动策划了GTPP处理后增加相互作用子的亚细胞位置
。 　　对于Hyper7测量值
，根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific） ，用不同的Hyper7（参考文献13）（参考文献13）（Addgene
，目录136466 、136469和136470）转染细胞。在37°C下以96孔板格式转染后24小时进行测量 。时间序列实时成像是使用CQ1共聚焦成像细胞仪（Yokogawa）进行的
。Hyper7用405 nm激光束依次激发。使用525/50-频道发射过滤器收集发射 。获取五个图像后，将10 µM GTPP添加到表达不同构建体的每组细胞中
。使用ImageJ（V.1.53）进行图像分析。计算成像细胞内部利益区域的荧光 。通过将激发的发射信号的强度除以488/405 nm ，计算高7的比率信号
。 　　使用SP8共共聚焦（Leica）对DNAJA1定位进行监测。将细胞在含有150 nm Mitotracker深红色FM（Thermo Fisher Scientific）的培养基中孵育30分钟
，在黑暗中37°C 。随后洗涤后，将细胞用PBS中的4％（Vol/vol）甲醛固定 ，并用0.01％（Vol/vol）Tritonx100透化
。用含有1％（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA），300毫米甘氨酸和0.1％的PBS缓冲液和0.1％（Vol/vol）Tween20在RT时阻塞细胞。将细胞在4°C下与1：100稀释液的抗DNAJA1抗体（11713-1-AP
，ProteIntech）中的PBS孵育，其中包含1％（wt/vol）BSA和0.1％（VOL/vol）Tween20 。3×洗涤后 ，使用1％BSA PBS中Alexa Fluor 488抗兔IgG的1：1,000稀释
，将细胞作为二抗体在RT时孵育1小时。一滴含有DAPI（Thermo Fisher Scientific）的延长钻石抗铁式甲植物用于安装细胞
。用Leica Application Suite X收集数据。使用ImageJ（V.1.53）进行图像分析 。Pearson和Mander的共定位系数是用JACOP插件计算的
。报告了独立图像的计算。 　　为了监测线粒体导入，MTS-EGFP（Addgene ，CatalogNo 。23214）与10 µM GTPP处理瞬时转染
。孵育6小时后
，将细胞用50 nm Mitotracker深红色FM（Thermo Fisher Scientific）染色15分钟，并转移至RPMI 10％胎牛血清进行活细胞成像。使用以下激光设置使用40倍放大倍率的CQ1（横川）：EGFP的488-nm激发和525/50-nm发射和640 nm激发 ，Mitotracker深红色FM进行685/40-nm的发射 。每个条件总共有100个细胞的三口手动表征为五个类别之一
。 　　对于晕Hag晕记者测定
，使用了稳定表达晕Hal标准ATP5A1和GREPL1的T-Rex-Hela细胞。通过在一夜之间孵育含有5 µM空吊带配体（Promega）的培养基中的细胞来孵育先前合成的Halo标签蛋白 。第二天开始治疗
。在处理的最后一小时，新合成的晕晕蛋白用5 µM Halotag TMR配体（Promega）标记。用50 nm Mitotracker深红色FM（Thermo Fisher Scientific）染色线粒体 。使用以下激光设置为40倍放大倍率的CQ1（横向川）：488-nm激发和561 nm激发的525/50-nm发射 ，Mitotracker深红色FM的CQ1和561-NM激发和561-NM激发和617/73 nm的发射。从三个独立的重复物中收集了几张图像
，并使用ImageJ（V.1.53）进行了图像分析
。Pearson和Mander的共定位系数是用JACOP插件计算的。报告了三个独立重复的计算 。 　　根据制造商的说明，用细胞计数KIT-8（DOJINDO）测量细胞活力
。用实验中使用的不同化学物质处理后 ，评估了细胞活力16小时（过夜）。 　　除非另有说明，否则用两尾学生的t检验进行一般统计分析（认为对P≤0.05很重要） 。所有图都是使用R软件包GGPLOT2（v.3.3.3）
，GPLOTS（v.3.1.1）和rcolorbrewer（v.1.1-2）创建的
。最终数字的可视化是用Adobe Illustrator CS5进行的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。