根瘤菌 - diatom共生的固定在海洋中缺失氮

　　“ tec.ti.glo’bus ”。L.过去的部分 。tectus，隐藏；L. Masc
。n。Globus ，一个球体；N.L.Masc 。n
。Tectiglobus
，一个隐藏的球体。 　　‘candidatus tectiglobus diatomicola’：di.a.to.mi’co.la 。N.L.女性n
。diatoma，硅藻；L. Suff。-Cola（来自L. Masc 。或Fem。N
。Incola） ，居民；N.L.Masc。n 。Diotomicola
，硅藻的居民
。 　　“ candidatus tectiglobus profundi
”：pro.fun’di。L. Gen 。n
。profundi，从海深处 ，指它从4,000 m深的沉积物陷阱中恢复。 　　在RV RV Maria S. Merian（Cruise MSM89; Bridgetown
，Barbados – Bridgetown，Barbados）和RV Meteor（Cruise M161; Bridgetown ，Bardgetown，Barbados – Ponta delgada
，Azores，Azores ，葡萄牙）的两次平行巡游中进行采样 。样品是从配备有电导率
，温度和深度（CTD）系统的Niskin Rosette采样器获得的
。在每个站点，使用稳定的同位素示踪剂进行CO2和N2固定速率的黎明孵化实验 ，进行CTD铸造以获取地表水（约10 m）。在孵育实验开始时
，采取了DNA和RNA测序和鱼类的子样本 。通过10-µm和3 µm聚碳酸酯过滤器（Isopore，直径为47 mm）的10 L海水进行顺序过滤进行DNA和RNA测序的样品 ，然后取出两个平行的0.22 µm selivex滤波器（在两个0.22-µm fileters中过滤了5 l的默克液体中的每个0.22 l;过滤后
，过滤器在液氮中闪烁，并将其储存在-80°C下直至加工
。在大约24小时孵育实验的结束时 ，进行了大容量速率和鱼类和单细胞分析的测量子样本。在RV Meteor巡游上
，通过依次约24小时的孵育期结束，在大约3 L孵育的海水中收集了其他DNA和RNA样品 。用无甲醇的甲醛溶液（1％w/v终浓度）保存鱼和纳米菌的样品在4°C约24小时 ，或在4°C下几个小时，然后在室温下0.5 h。随后将保留的样品过滤到聚碳酸酯过滤器上（Isopore
，0.2 µm孔径，直径25 mm）；将用于纳米菌素分析的所有样品均过滤到金（AU）涂层的聚碳酸酯过滤器上
。随后将过滤器用超纯水（MILLIQ）冲洗 ，干燥并在-20°C下储存
，直到进一步分析。 　　选择了总共八个站的样品进行DNA和RNA提取物，以及随后的长和短阅读的元基因组和元文字测序 。所有库准备步骤和测序均在Max Planck基因组中心（http://mpgc.mpipz.mpg.de/home/）进行
。有关样品 ，DNA和RNA提取方案的详细信息
，请参见补充方法，用于简短和长阅读测序以及质量修剪的库准备。 　　大约的基因组 。从深度测序的短读宏基因组样品（约315 GB ，3-10 µm的大小3-10 µm）孵育后
，从M161巡游中的站4，位于地表水的大小约为3-10 µm ，以及来自MSM89巡航的六个站点（所有大小）巡航的六个站点（所有尺寸）
，从地表水上进行的六个站点，从地表水上进行了cribe（All Read Read Metagenomes） ，从地表水上进行了cribe（随后），T
。diotomicola是从地表水（M161巡游中的315 GB
，3-10 µm尺寸）重建的。使用Trimmomatic38 V.0.39（IlluminAclip：Truseq3-pe.fa：2：30：10，领导：3 ，尾随：3
，slidingwindow：4：15，minlen：36） ，使用Trimmanic 38 V.0.39（Illuminaclip：truseq3-pe.fa：2：30：10）修剪原始的宏基因组短读数
，并使用megahit39 v.1.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.9 。为了减少组件的大小（3300万个重叠群，总计约17.7 GB） ，它被过滤以仅保留长度超过2 kb
，25–40％的GC含量和29-44的重叠群；后两个参数是根据CA的初步重建选择的
。T. diatomicola基因组（有关更多详细信息，请参见补充方法）。在ANVI’O40 v.7.1中可视化了其余的8,218个重叠群 ，并且与先前重建的CA相似 。使用BLASTN（BLAST+（参考文献41）v.2.9.0）鉴定了甲状腺菌基因组
。使用这种方法
，一个由189个重叠群组成的紧密聚集组，其中大多数与先前重建的CA的重叠群匹配。T. diatomicola在Anvi’o40 v.7.1中鉴定出来 。然后 ，迭代扩展和完善了189个重叠群，其中一个迭代包括以下步骤（请参阅“代码可用性”）。使用minimap2（参考文献42）v.2.22-r1101（``-ax map-hifi''''（用于长读数的“ -ax map-hifi''）将长和短的宏基因组读取映射到重叠仪上使用Coverm v.0.6.1（https://github.com/wwood/coverm）98％的身份（仅用于简短读取的读取长度的80％以上）
。使用Samtools43 v.1.14（“ Samtools fasta ”）将剩余的映射长读数和短读数转换为FastA格式。使用SEQKIT44 v.2.3.0完成了仅完成映射单个读取的短读对 。Subsequently, mapped long and short reads were assembled together using SPAdes45 v.3.15.3 (‘--isolate -k 21,33,55,77,99,111’, mapped long reads were supplied using ‘-s’ and scaffolds of the previous iteration were supplied using ‘--trusted-contigs’) and the assembled scaffolds were filtered to retain only scaffolds of at least 1 kb.然后将过滤的支架用作下一次迭代的输入
。23次迭代后
，使用ANVI’O40 v.7.1手动检查和完善脚手架，从而导致当前CA。T.硅藻基因组 。使用CheckM2（参考文献46）v.0.1.2估算完整性和冗余 ，并使用GTDB-TK47 v.2.1.0和基因组分类数据库（GTDB）16 V.R214分类分类法
。 　　大约T. diatomicola基因组首先使用Prokka48 v.1.14.6进行注释。有关基因功能的其他信息来自RAST Web Server49（https://rast.nmpdr.org/）
，以及通过Diamond50 v.2.0.8使用squm_annot.plalliest'squm_annot.plains.2 v.4.5的相似性搜索与kegg51 v.58和giggnog52 v.4.5 v.4.5数据库 。实用脚本“ sqm_annot.pl
”进一步用于使用最后一个共同的祖先方法进行所有编码序列的分类注释53
。对于在编码重叠群的NIF群集上的感兴趣基因，使用系统发育分析和/或手动检查其最佳爆炸命中率进一步研究了分类学起源（请参阅补充方法）。使用InterPro Web Server54 v.95.0-97.0（https://www.ebi.ac.ac.uk/interpro/result/result/interproscan）进一步检查了高度转录的基因（前20％） ，并使用NCBI-NR Database55进行搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi） 。 　　两个Ca的基因含量
。将Tectiglobus基因组与两个密切相关的MAG（GCA_905480435和GCA_002689605）进行了比较。使用ANVI’O40 v.7.1（https://merenlab.org/2016/10/10/10/10/25/cog-annotation/）和每个COG类别中的基因对每个基因组的基因进行注释 。全基因组对齐和鉴定两个CA内的保守区域的块。使用Mauve56（开发快照2015-02-26）进行构件基因组
。 　　Ca的最大可能性系统发育树。T. Diotomicola
，CA 。T. Profundi以及来自GTDB16（V.R214）的所有根瘤菌和帕维巴菌（Outgroup）基因组以及HBD_ALPHA_05（来自含NIF基因5的菌丝细胞科族的海洋杂志（来自菌丝细菌科的海洋杂志）也根据16 corosom proten forsen usee usey usey use 3.8 ussy use 3.对齐和FastTree59 v.2.1.11用于树计算
。在Itol60 v.6.8.1中可视化了所得树。有关标记蛋白（NIFH，NIFD ，NIFK
，NIFE，NIFE ，NIFN
，NIFB，NIFB ，NIFS和CCON）的更多细节和系统发育，请参见补充方法 。 　　获得CA的基因转录信息
。T. diatomicola
，所有测序的元文字读数均合并并映射到CA。T.使用BWA-MEM61 V.0.7.17-R1188的T.硅藻基因组进行过滤，并过滤所得的映射文件 ，需要至少95％的序列身份
，并且至少80％的读取到对齐（映射和过滤是通过Coverm v.0.6.1进行的） 。使用Trafurecounts62 v.2.0.1和蛋白质编码基因的TPM值生成基因计数，如先前所述63
。使用BRIG64 V.0.95和DNAPLOTTER65 V.18.1.0生成了包括TPM值的基因组图（图2A）。 　　确定大约的全球分布和丰度 。T. Diotomicola和CA
。T. Profundi ，我们分析了它们在宏基因组和公开可用QPCR数据中的存在。为此
，我们使用了Tara Oceans运动中的宏基因组（PRJEB4352项目中的1,241个宏基因组，Prjeb1787 ，Prjeb9691和Prjeb9740）和宏基因组
，我们从热带的North North North thllictic and South Pacific deptific deptercepter（参见The The Mecenagenomes）（参见4） 。将两个基因组中每个基因组的重叠群串联（不包括编码rRNA基因簇以减少非特异性读取募集的区域）和宏基因组学读取的映射，并使用bbmap v.38.70（https://sourceforge..net/prodement/prodejectss/prodejectss/bbbmap/）绘制了90％的标识。当覆盖范围的广度（至少一个读取的基因组的一部分）接近先前报道的公式66：覆盖范围的范围（至少一个读取的基因组的一部分）时 ，我们仅认为每个基因组存在于元基因组中： 　　预期广度= 1 - E（-0.883×覆盖范围）（扩展数据图5C
，D）
。 　　此外，我们从先前的研究8中下载了γ-A（即Ca. T. diotomicola）NIFH QPCR数据67（称为NCD_GAMMAA_NIFH_GENE和NCD_G24774A11_NIFH_GENE ，大约2,500个数据点）滤除了所有样品，计数值为0。然后
，我们绘制了所有宏基因组的坐标，其中两个ca 。与对数转换的Ca一起检测到构件基因组
。T. Diotomicola NIFH QPCR使用R68在世界地图上进行计数（图4）。QPCR样品中有大约 。T. diotomicola（Gamma-A）NIFH的计数值为0分别绘制（扩展数据图5B）
。 　　在补充信息中描述的测序数据分析过程中使用的其他软件：hifiasm-meta69 v.0.2-r043用于组装长读元基因组；比较V.0.1.2（https://github.com/dparks1134/comparem）用于计算Ca之间的平均氨基酸身份。T.硅藻菌和密切相关的基因组；FastAni70 v.1.33用于计算初步磁磁之间的平均核苷酸身份；usearch71 v.11.0.667用于基于系统发育构造之前的相似性；MAFFT72 v.7.505用于计算和Trimal73 v.1.4.1 ，用于修剪多个序列比对；Modelfinder74用于预测最合适的模型；和UFBOOT2（参考75）
，用于计算具有IQ-Tree76 v.2.2.2.0.3和v.2.2.2.7的最大似然树期间的超快引导程序 。以下软件用作Squeezemeta Metagenomics Pipeline53 v.1.6.2：BarrNAP 0.9-DEV（https：//github.com/tseemann/barrnap）进行核糖体RNA的预测；RDP分类器77 v.2.10.2用于预测16S rRNA序列的分类分类；prodigal78 v.2.6.3用于基因预测；HMMER v.3.1b2（http://hmmer.org/）用于针对PFAM数据库的HMM同源性搜索；Bowtie2（参考文献80）v.2.3.4.1用于映射简短读数；Metabat 2（参考文献81）v.2.12.1，Maxbin 2.0（参考文献82）和Concoct83 V1.1.0 ，用于将重叠群的固定在MAGS中；DAS Tool84 v.1.1.1用于整合三个包装工具的结果；和BBDUK v38.87（https://sourceforge.net/projects/bbmap/）用于修剪元文字读取
。 　　如先前所述的10,85（补充方法中的详细描述）确定二氧化碳和N2固定的速率。稳定的同位素孵育（15N-N2和13C-DIC（溶解的无机碳）一式三份进行24小时（黎明至黎明） 。将瓶子与表面海水连续冲洗的甲板孵化器中孵育
，并具有模拟的光条件86
。大约24小时后，取下元样本进行元素和同位素生物量分析 ，以及鱼类和纳米smims分析。根据将13C和15N掺入生物量（即同位素组成的变化）的基础上计算固定速率（补充方法） 。 　　可视化新确定的ca。T. Diotomicola
，我们设计了针对16S rRNA87,88的鱼类探针（补充方法）
。总共设计了四个鱼类探针：两个专门针对CA的探针。T. diotomicola（Hypho825和Hypho638）和两个具有更广泛的覆盖范围，针对许多菌丝细菌科（杂种1147）的成员和几个菌菌科菌科属菌科菌群菌丝菌群 ，菌丝和菲洛姆菌
，菲洛姆菌和小树脂的方法2（andpho）的数据（andpho7334）这些新探针的最佳甲酰胺浓度使用克隆 - fish89（补充方法）测试 。 　　大约使用催化记者沉积法（card-fish）与四个新的辣根过氧化物酶（HRP）标记的探针一起观察到甲状腺链球菌细胞，可以单独或组合（双重杂交）以及与助手或竞争者一起增加信号强度（扩展数据表2）
。如前所述90进行卡片。Microscopy was performed using a Zeiss Axio Imager.M2 wide-field epifluorescence microscope equipped with a Zeiss Axiocam 506 mono camera and Zeiss ZEN 3.2 blue edition software, a Zeiss LSM 780 confocal laser scanning microscope equipped with Zeiss Elyra PS.1 super-resolution-structured illumination microscopy and a laser microdissection（LMD）显微镜（LMD 7000 ，Leica） 。为了更好地识别ca的硅藻宿主
。T. diotomicola，含有鱼阳性细胞的宿主硅藻
，通过SEM使用FEI Quanta 250 FEG ESEM（Thermo Fisher Scientific，FEI）可视化（请参阅补充方法）。大约的丰度甲状腺菌 - haslea共生t 。确定为含有鱼阳性细胞的硅藻宿主的数量 ，来自代表25 ml采样的水的过滤器碎片（扩展数据表1）
。 　　使用LMD显微镜（LMD 7000
，leica，LMD 7000 ，LMD 7000）
，通过形态学和叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和/或叶绿素a-和叶绿素a-和叶绿素A-和/或叶绿素a-和叶绿素a-和叶绿素a-和植物相关（LMD 7000，leica）通过形态学和/或叶绿素A-和/或叶绿素A-发现Richelia与几内亚硅藻有关 ，有时也称为根瘤菌和半肌。确定丰度是含有Richelia的宿主硅藻的数量 。通过测量所有自由毛刺的总长度
，并将总毛状体长度除以平均细胞长度来确定毛刺的丰度
。通过直接细胞计数确定鳄鱼细胞的丰度。从代表大约300-360 mL抽水的整个过滤器中确定丰度（扩展数据表1） 。 　　从稳定的同位素孵育末端的AU输出过滤器用于纳米菌素（Nanosims 50L，Cameca） ，以测量单细胞碳和氮同位素组成
，并确定CA的单细胞CO2和N2固定活性。T. diotomicola及其Haslea宿主以及Richelia及其硅藻宿主（半叶和几内亚氏菌）（扩展数据表1）
。如上所述，对两种目标共生性进行了可视化 ，并随后使用LMD显微镜（LMD 7000，Leica）标记。如先前所述的90
，进行了纳米菌素分析，并在补充方法中提供了详细信息 。感兴趣区域的同位素比（13C/12C和12C15N/12C14N）通过覆盖鱼类阳性细胞及其宿主硅藻的表落荧光图像（对于diatomicola – Haslea symbiosis）或介绍型（diatiatom-ipersons compansiria）（richeria）（sectiage cipdiate richelia）（sectiage cissip cipdate risselia）（nNANELIA）（sectiage cipdation）（richelia）（sectiage cipdiate rishelia）
。对于元素成像（扩展数据图7） ，碳（12C）
，氮（12C14N）和二级电子被覆盖；仅对于此图像，删除了背景信号。组合细胞率和丰度以确定CA的绝对贡献 。如先前所述的1010
。对于Ca.T. diotomicola – Haslea共生和硅藻相关的Richelia ，还考虑了硅藻中回收的氮量。使用先前的Report10和质量平衡宿主和共生体中提供的方程式确定了单个细胞的碳生长速率以及整个共生率 。我们研究中的单细胞活动和贡献可以被认为是保守的
，因为在样本制备过程中可以稀释13C/12C和15N/14N的比率，这可能导致低估91,92,93
。 　　对于图1B ，C
，相关性SEM和荧光（共焦以及落荧光）图像代表了来自3个独立环境样品的地表水的总共11个硅藻。从6个独立的环境样品中总共获得了27个硅藻获得其他荧光图像（图1C） 。 　　对于图3a，b ，相关的纳米图像图像代表了来自3个独立环境样本的总共16个硅藻（总共包含64个共生体）
。 　　对于庞大的数据
，图4，相关荧光（共聚焦和落荧光）和SEM图像（扩展数据图4A -D）代表了来自5个独立环境样品的总共13个硅藻 ，其中包含超过4个共生体。非338探针图像（扩展数据图4E）代表了来自3个独立环境样本的总共32个硅藻 。但是，叶绿体并不总是可见。扩展数据图4F
，显示Ca
。与特异性寡核苷酸探针杂交后，与H形核和​​双叶叶llorobeloplasts杂交后的甲状腺硅藻细胞代表了来自3个独立环境样品的总共18个硅藻。显示整个硅藻的SEM图像（扩展数据图4G）代表了来自2个独立环境样品的总共19个硅藻 。扩展数据图4H – K显示了有助于识别硅藻宿主的放大图像的选择
。 　　对于扩展数据图7 ，分析了一个硅藻。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。