衰老的胶质链接线粒体功能障碍和脂质积累

　　在12-12 h的光线周期下，在25°C的标准玉米面蝇食物上饲养苍蝇 ，并在标准玉米面蝇食物上升高60％ 。所有实验均用雄性果蝇进行，以最大程度地减少生物学方差
，因为男性和雌性苍蝇以明显不同的速度年龄。每48小时将苍蝇转移到新鲜食品小瓶中，饲养为20人群 ，并随机分配到实验条件下
。对于Geneswitch（可诱导的GAL4-UAS）41实验
，用100μlRU-486（100％EtOH中的4 mg ml-1; Sigma-Aldrich，M8046-1G）或媒介物（100％ETOH）制备食物 ，将食物移到食物上
，并允许食物瓶中并允许干燥24小时。有关基因型和库存信息，请参见补充信息中的补充表1 。 　　对于神经元表达的UAS-RNAI实验 ，将果蝇收集到成人eClosion时（0天）的RU-486食物上
，并在29°C饲养
。 　　对于AP1封锁实验，在成人eClosion（0天龄）时 ，将苍蝇收集到车辆或RU-486食物上。通过将苍蝇翻转到车辆食物中
，连续（每周7天）连续地（每周7天）（每周3或1天）将动物保持在RU-486上 。所有实验和样品收集每周1天RU-486治疗的果蝇均使用动物在车辆食品上进行，特别是在上次RU-486进食后6天 ，以确保Geneswitch终止41
。根据测定选择对照。对于BODIPY实验，将基因型匹配的动物用作对照
，作为GFP干扰了BODIPY检测 。 　　为了衡量生存，每2天将死亡和/或审查的苍蝇数量记录在新鲜食物中；将苍蝇饲养为每只20个小瓶 ，每个基因型和实验至少100蝇
，至少重复两次
。为了测量攀岩，将苍蝇在空的小瓶中单室 ，并允许适应30分钟。通过将果蝇敲入小瓶的底部
，然后在30秒内在三个试验中以5分钟的测试间隔攀升，从而测量攀爬 。在斐济确定了平均的攀登高度
。数据表示为最大小瓶高度（8厘米）的百分比。如参考文献中所述进行热休克评估 。61。简而言之 ，将苍蝇转移到清除塑料13毫升小瓶中
，每个小瓶含有15个苍蝇
。小瓶和苍蝇在38.5°C的压力下转移到水浴中1小时。然后将苍蝇转移到新鲜食物中，并允许在25°C下过夜 ，然后每个小瓶记录活着与死亡的苍蝇百分比 。氧化应激（H2O2喂养）：成年蝇是单人体的
，并在5％的蔗糖 - 阿戈尔或1％H2O2蔗糖 - agar上加载了果蝇活性监测系统
。将活性记录10天，然后使用Rethomics Package62在R环境中进行分析 ，以确定动物死亡的时间并产生生存曲线。 　　所有工作均在无RNase条件下进行 。为了创建用于基于FACS的分选的细胞悬浮液，在Schneider的培养基中迅速剖析了成年蝇脑（RNA-SEQ的每= 20个大脑n = n =每次复制的大脑； n = 40个大脑
，用于脂肪态分析）迅速剖析，并在45μm放线肌蛋白D并储存在冰上直至解剖
。然后将大脑在冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）（3×）中洗涤。通过酶促和物理解离 ，如下所示：在分离缓冲液中（300μL活性木瓜
，沃辛顿Pap2 LK003178和4.1μlLiberase，Roche 5401119001）在25°C的振荡器上孵育单个细胞悬浮液 。在孵育过程中 ，在5和10分钟时
，通过移液轻轻匀浆组织
。在15分钟时，整个匀浆通过25克5/8针（7倍）。在20分钟时 ，通过添加Cold Schneider的培养基来停止酶活性 。然后将细胞应压（35μM滤波器）
，颗粒（800G，7分钟） ，并用放线霉素D和2.5μL的RNase抑制剂（Takara重组RNase RNase抑制剂
，目录2313A）中悬浮在冷施耐德的培养基中
。将细胞重悬于250μL中，用5μM4,6-二酰衍射2-苯基吲哚（DAPI）和50 nm SYTO60（核标记； Thermofisher ，S11342NO。S11342）进行对抗，并由Penn Cytomics和Cell Seting Facity使用BD Face ii sorp（100 mmmmmmmmmmmmmm）进行排序 。通过DAPI摄取将死细胞排除在外。通过FSC-W和SSC-H通过SSC-W参数将双重组通过FSC-H排除
。SYTO60包括核细胞。通过GFP鉴定神经胶质
，神经元为GFP阴性 。通过DSRED确定AP1活性
。门控策略在扩展数据中显示了图1C。 　　对于散装RNA-Seq，每次重复收集了500个神经元 ，500个神经元
，500个AP1+ Glia和500个AP1NEG神经胶质，每种细胞类型的重复4个 。对于脂质组分析 ，每次重复收集100,000个神经元
，100,000个AP1NEG神经胶质和35,000个AP1+ Glia，每种细胞类型的重复5-6个
。立即将细胞在-80°C下冷冻直至进一步加工。组织和细胞分离的总处理大约需要3小时 。使用FlowJo v.10.8.1分析了该排序的数据
。为了生成细胞和DNA含量图 ，使用归一化为模式的绝对细胞计数覆盖了具有不同n的细胞群体（在分布模式下达到峰高）。 　　对于免疫染色的FACS分离细胞
，在解离和重悬于上述后，在室温下将细胞固定在4％多聚甲醛中15分钟 。将细胞洗涤 ，然后在冰上重悬于5％的正常山羊血清（NGS）5分钟
。接下来将细胞在室温下在原代抗体（1:20小鼠抗γH2AV
，DSHB UNC93-5.2.1）中孵育30分钟，在次级抗体中洗涤和孵育30分钟（1：200山羊抗鼠Alexafluor 647 ，Thermofisher Scientific，Thermofisher Scientific
，Catalog Scientific，Catalog No.A-21235）供室温下30分钟。门控参数如上所述 。如上所述 ，使用BD FACS ARIA II SORP立即分析细胞。 　　对于分类的细胞
，RNA隔离，库制备（Smart-Seq V.4）和RNA-Seq（Illumina 2×1.50亿4000万个对每个样品的配对读数；每个方向2000万个方向）
。对于整个大脑 ，每个条件都剖析了大约10-12个大脑。使用Zymo RNA清洁和浓缩剂-5试剂盒（Zymo
，R1013）提取总RNA，并在Trizol/氯仿提取方案加上柱上DNASEI处理后使用水相中的RNA清除 。RNA量通过纳米体测量 ，并使用RNA纳米芯片通过Agilent 2100生物分析仪验证完整性
。Admera Health执行了RNA-Seq库（用poly-A选择的TruseQ和测序）和测序（Illumina Novaseq S4
，带有4000万个配对末端读数； 2×150 bp）。为每种样本类型，实验时间点 ，状况和基因型生成了四个生物学重复 。 　　通过质量控制滤波器（Q> 30）从BASESPACE获得
，然后在每个样品中合并，每个样品总计大约2000万个读取
。使用HISAT2（v.2.1.0）63将配对末端的读数与苍蝇基因组对齐。HISAT2索引是由Flybase的果蝇Melanogaster参考基因组R6.17构建的 。在测序运行（PICARD）64中合并了每个样本的对齐排序的BAM文件（Samtools v.15）
。读取与外显子区域唯一对齐的htseq（v.0.9.1）65与联合设置进行计数 ，以在R环境中使用deseq2（参考文献66）软件包产生计数矩阵进行差分表达分析。如果涉及两个或多个关键变量（即基因型和年龄）或设计模型公式是单个密钥变量（即基因型），则设计模型公式为“〜组 ” 。对样品进行了成对比较（即“对比= c（'组）”）
，使用lfcshrink（）施加了0.05的alpha截止
。使用所有表达基因作为背景（n大约15,694），使用Flymine.org的工具在Flymine.org上使用工具进行了基因本体学和Reactome途径富集。请参阅指示的补充数据 ，以跨实验之间的样品和/或组之间的差异表达基因 。 　　对于脂肪组分析细胞
，如上所述，将FACS分离。在PBS中迅速阐明大脑 ，通过离心颗粒
，并在-80°C下去除过量的PBS以冷冻直至进一步加工（n = 8大脑复制；每个基因型和/或年龄的5-6个复制）
。使用略微修饰的Bligh＆Dyer提取程序制备了FACS分类细胞和全脑样品的脂质提取物67。简而言之，将冷冻样品在室温下解冻10分钟 ，并加入200μl的超纯水以促进裂解
，然后再进行450μl的甲醇和250μl高性能液相色谱级氯仿 。将样品涡旋10 s，导致单相溶液 ，并在4°C下孵育15分钟
。接下来
，加入250μl的超纯水和250μl氯仿，产生双相溶液。将样品以14,000克离心10分钟 ，导致管中三个相 。将包含脂质的底部有机相转移到新管中，然后在真空浓缩器中蒸发
，留在干燥的脂质提取物后面
。 　　如前所述进行了提取的脂质的多重反应监测分析。68 。将干燥的脂质提取物溶解在100μL甲醇：氯仿（3：1 V/V）中，以制成脂质储备溶液
。在分析之前 ，在注射溶剂7：3甲醇：乙腈：乙腈：乙腈中进一步稀释三倍
，直接在分析前。仅注射溶剂而没有任何脂质被用作“空白
”样品 。 　　通过流量注射（即没有色谱分离），获取质谱数据3分钟
。简而言之 ，将8μl稀释的脂质提取物储备溶液输送到敏捷6495c三倍四极杆质谱仪的喷气流技术离子源（AJS）源。基于脂质图数据库的十个主要脂质类别
，将多种反应监测方法组织成11种方法 。有关单个物种筛选的脂质和补充数据17的总N，请参见图9D。根据脂肪酸中性损失残基 ，将标签分为两种单独的方法
。 　　使用EDGER软件包69进行统计分析。Edger使用广义线性模型来识别差异表达的脂质 。广义线性模型基于负二项式分布
，该分布将空白与分散术语结合使用，使用共同的分散方法70
。这使其可以对技术和生物学变异性进行建模。先前在参考文献中详细描述了此方法 。68
。根据错误的发现率值选择了重要的脂质 <0.1 (ref. 71). 　　A standard protocol was used for fixation and staining. In brief, adult fly brains were dissected in cold PBS and fixed in 4% paraformaldehyde (v/v) for 50 min at room temperature. Brains were washed and permeabilized in PBS-0.1% Triton-X (PBST; 3×, 10 min). Samples were blocked in PBST-5% NGS at room temperature for 1 h, then incubated for 24–48 h at 4 °C with 1° antibody (1:25 mouse anti-repo, DSHB 8D12; 1:20 rat anti-elav, DSHB 7E8A10). Brains were washed in PBST then incubated with fluorescently conjugated 2° antibody for 1 h at room temperature. For AP1 activity (all genotypes containing TRE-dsRed) and tdTomato, endogenous fluorophore luminescence was measured without additional antibody staining. Brains were counterstained with Hoechst (0.10 mg ml−1 in PBS) for 15 min, cleared in mounting media (20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 80% glycerol, PBS), mounted in mounting media and cover slipped. Brains were imaged by confocal microscopy (Leica DM 6000 CS) with identical laser power and gain settings across experiments. Images were acquired throughout the full brain at 2 μM steps at 1,024 × 1,024 resolution by ×20 (dry) or ×63 (oil) objectives. 　　For BODIPY, brains were dissected and fixed as above then incubated for 24–48 h at room temperature in 1:250 dilution of 10 mg ml−1 BODIPY 493/503 (Invitrogen D3922) prepared in NGS. Brains were washed in PBST, counterstained with Hoechst and prepared for imaging as above. 　　For DHE, fly brains were rapidly dissected in cold Schneider’s medium, incubated in 60 μM DHE (ThermoFisher, catalogue no. D11347) for 7 min at room temperature shaking. Brains were washed in Schneider’s medium (2×, 5 min) then PBS (1×, 5 min), mounted in mounting media and imaged immediately (excitation 488 nm, emission 515–656 nm). 　　Fiji v.2.0 was used for analysing all images. For TRE-dsRed quantification, dsRed was measured in Fiji as raw integrated density in scaled images of the z stacked brain. For BODIPY 493/503 quantification, background was first subtracted from scaled images of the z stacked brains. Automatic thresholding was applied and Analyze Particles (Analyze>分析粒子）用于确定bodipy+液滴的数量 ，平均大小和总面积。 　　对协议进行了调整为72
，用于在整个果蝇脑中染色 。简而言之，在冷PBS中解剖成年蝇脑 ，并在2％的多聚甲醛和0.2％的戊二醛（V/V）中固定30分钟
。Brains were washed in PBS (3×, 5 min) then incubated in 150 μl of X-Gal staining solution (40 mM citric acid phosphate buffer, 5 mM potassium hexanocyanoferrate(II) trihydrate, 5 mM potassium hexanocyanoferrate(III), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2-6H2O, 2.44 mMx-gal）在黑暗摇动（300 rpm）的37°C下，根据基因型（大约12-24 h）的预定时间。在PBS（3×
，5分钟）中洗涤大脑，并在上面的安装介质中清除 。在APO16显微镜上成像大脑 ，并通过转换为红色
，绿色和蓝色堆栈以及仅在红色通道中的红色，绿色和蓝色堆栈以及中位数来定量染色
。倒密度是通过从255中减去中位灰度值来计算的 ，并将其标准化为同时处理的对照
，以说明实验之间的可变性。 　　Fly brains were rapidly dissected in cold PBS (n = 8 brains per biological replicate), then homogenized in 5 μl of sample buffer per brain (1× Laemmli Buffer (Bio-Rad, catalogue no. 161-0737), 1× cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma, catalogue no.P7626），50μlβ-苯甲醇（BME）：Sigma ，目录NO 。将样品变性（98°C持续3分钟）
，然后再加载到4–12％BIS-Tris凝胶上。每样品的体积相当于1×MES缓冲液，通过电泳转移至0.45μm硝酸纤维素膜过夜
。Ponceau S染色以确认转移。将膜在1×Tris缓冲盐中的3％牛血清白蛋白中封闭 ，0.1％Tween 20洗涤剂
，在4°C中孵育过夜（1：200小鼠抗γH2AV，DSHB UNC93-5.2.1; 1：1：2,000） 。将印迹与1：5,000物种适合HRP的HRP偶联的二抗稀释在室温下1小时 ，然后在ECL（以前是GE Healthcare Life Sciences），CatalogNO
。RPN2232的ECL（以前是GE Healthcare Life Sciences）中检测到
，使用Amersham Imartification 600。将样品蛋白标准化为负载对照α小管蛋白 。如前所述，使用标准技术将哺乳动物细胞裂解 ，并使用标准技术印迹73使用JUN的抗体（1：1,000；细胞信号技术
，目录号为9165）
。 　　通过解剖从Eclosion带来的0.2毫米EDU食品上保持苍蝇。根据制造商的协议（Click-It Edu成像套件； Thermofisher，目录编号MP10338）进行EDU染色 。简而言之 ，将大脑解剖并固定在上述以进行免疫组织化学
。透化后
，将大脑在单击的反应混合物中在4°C中孵育过夜。将大脑洗涤，用Hoechst对上述 ，清除
，安装和成像 。 　　使用Promega线粒体弓形测定法（G8001）确定ATP/细胞毒性的比率
。遵循制造商的说明。测定裂解物由至少三个实验的单个解剖的蝇脑（每个基因型或条件n = 3-4个大脑）组成 。样品始终归一化为并行处理的对照。 　　适用于测量成年苍蝇头34中的mtDNA的方案34
。为了收集头部，通过二氧化碳将整个苍蝇麻醉 ，并通过液氮中的浸没冷冻
，然后涡旋以将头部与身体分开。通过在30 µL工作溶液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 ，1 mM EDTA，0.1％Triton-X-100和10μgml-1蛋白酶K）中均质化五个头（每次复制）提取总细胞DNA 。然后将样品在37°C下孵育60分钟
，然后在95°C下灭活蛋白酶K 10分钟
。通过在室温下以12,000克离心10分钟的样品将头部角质层固定。在测量纳米旋风中测量DNA浓度之前，将上清液转移到新管中 。使用核DNA（GAPDH）作为对照在实时定量PCR（QPCR）中对mtDNA进行定量
。底漆序列：mtDNA-F1 ，GaattaggacatCctggagc和mtDNA-R1
，GCACTAATCAATTTCCAAATCC；GAPDH-F1，GACGAAATCAAGGCTAAGGTCG和GAPDH-R1 ，AATGGGTGTGTCGCTGAAGAAGTC。 　　通过RNeasy Mini Kit（Qiagen
，CatalogNo 。74104）从蝇脑或头部（n = 8-20复制）中分离总RNA，并在柱上去除基因组DNA（Qiagen ，CatalogNo
。79254）。从总RNA（Applied Biosystems
，CatalogNo 。4368814）中制备了互补的DNA（cDNA），然后通过Qubit ssDNA分析（Invitrogen ，Catalogno
。Q10212）量化。使用快速SYBR绿色试剂（Thermofisher
，CatalogNo 。4385612）在384孔板中以每个反应为20 ng的cDNA，并在VIIA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行分析。使用∆ΔCT方法确定相对表达
。对于每个样本 ，平均CT值是根据2-3个技术重复确定的。∆CT是根据管家基因β-微管蛋白确定的 。然后将相对于对照组计算为倍数变化
。实时QPCR引物来自Flyprimerbank74或以前的出版物，针对果蝇基因组的BLASTD具有特异性
，并通过连续稀释曲线和熔体曲线分析进行了优化。有关引物序列，请参见补充表2 。 　　IMR90原代人成纤维细胞（ATCC CCL-186）在Dulbecco修改后的Eagle的培养基（Gibco ，CatalogNo
。10313-121）中生长在37°C
，3.5％O2，5％CO2 ，具有10％FBS（Cornogno。35-011-CV）
，gib co coce no.35-011-coce coce coce no.35-0 fbs 。15140-122）和2毫米谷氨酰胺（Gibco，目录编号25030-081）
。经常检查培养物是否有支原体污染。20–30％汇合细胞的X射线照射的20灰色诱导辐射衰老 。辐照后3天返回汇合后 ，分裂细胞
。在辐照后第4天和第7天
，将细胞用四个小型裂化RNA池对JUN（Dharmacon Sigenome）或非靶向对照（SINTC＃3，Dharmacon Sigenome组）转染 ，最终浓度为0.8％DHARMAFECT遵循制造商协议后的0.8％DHARMAFECT。每次转染后18-20小时更换培养基 。从辐照后的第8-10天开始
，或从平行培养的正常增殖的IMR90细胞中收集，以500g离心3分钟 ，以去除全细胞和大碎屑，然后添加到20–30％融合的增殖IMR90细胞中
，在96-Well Immer，catalog ，catalog
，catalog，catalog ，catalog
，catalog no no。no
。for。将细胞固定在10％中性缓冲福尔马林（EPREDIA，目录号9400-1）中 ，并用500 µg ML-1 DAPI和5 µg ML-1 Bodipy 493/503（Cayman
，目录No 。25892）在PBS中染色
。细胞的自动成像是在尼康Ti2显微镜上进行的，并在NIS元素中分析了图像。 　　统计分析和数据可视化是在R环境中使用rstudio和基本r和包装的RSTUDIO进行的 。没有使用统计方法来预先确定样本量；果蝇的标准样本量使用了两个或三个独立的实验中
。请参阅源数据文件 ，以获取与每个主数据图相对应的数据和统计报告。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。