在麻醉下（每公斤氯胺酮60-100 mg，每公斤甲基嗪 ，腹膜内（i.p.）注射） ，在8-12周大的雄性小鼠中进行实验程序 。在微填充之前，使用淡淡的剥离霜去除耳朵，然后用水冲洗 ，干燥和耳朵的背侧用双面胶带固定 ，以暴露腹侧 。通过应用P.L.A.S.E.进行71 µM深度和9％孔密度的微构池。使用先前已针对细胞系列的自定义程序验证了耳朵腹侧的激光设备（PANTEC生物溶液）。在微层次过程之后，150 µl肿瘤细胞悬浮液（EMT6-EGFP ，CT26-RFP ，4T1-MTAGBFP2，KPP-EGFP ，KPP-MTAGBFP ，KPP-MTAGBFP2，KPP-EGFP-OVA ，KPP-EGFP-OVA ，NSCLC-EGFP或NSCLC-EGFP或B16F10均应在40 – 80 – 80 – 80×106细胞中使用）边 。将细胞孵育30分钟，然后去除多余的细胞悬浮液 ，孔盖上毛孔（康宁）并孵育15分钟 ，直到Matrigel聚合 。肿瘤植入后5至12天，微肿块的生长根据细胞系而变得明显。一旦观察到肿瘤，就会观察到小鼠 ，并每周至少测量两次肿瘤 。如果观察到任何其他不良反应 ，则根据兽医的方向，监测频率会增加 。如果肿瘤区域达到或超过70％或总耳朵表面 ，或者肿瘤不超出IACUC啮齿动物的肿瘤指南 ，则立即将小鼠安乐死。此外，如果耳朵处于损害正常耳朵和身体功能的状态 ，则由兽医确定 ， 小鼠被安乐死了 。任何表现出其他出乎意料的不良反应的小鼠，例如严重的驼背或严重的嗜睡或任何垂死小鼠 ，都会立即安乐死 。至少每周称重小鼠 ，每天称重那些体重> 15％的小鼠。降低了20％体重的动物被安乐死或引起兽医的注意 。身体状况评分为2分或以下的小鼠被安乐死 。
B16F10，EMT6 ，CT26和4T1小鼠亲属系列来自ATCC。KPP（PDAC）和NSCLC细胞源自Genentech癌症免疫学GEMM小鼠的原发性肿瘤 。使用PiggyBac载体在房屋中进一步设计了父母细胞系 ，以过表达不同类型的荧光记者（EGFP，RFP或MTAGBFP2）或/和/和/和模型抗原（包括M86 Neoantigen）的肿瘤新抗原的肿瘤新抗原肽或decam蛋白肽（卵形蛋白或decamer肽） 。Genentech建立了集中式细胞库GCELL，以支持Genentech中基于细胞的研究的需求。GCELL的任务是经过验证的 ，质量保存的细胞系 ，用于在整个Genentech中分发。这为所有级别的研究提供了一致的细胞系来源，以实现实验性可重复性并访问基线信息 ，例如形态学 ，生长条件，RNA-Seq和全外观测序 。GCELL还提供了一种重要的机制 ，以确保根据所有条款和条件使用细胞系 。在细胞冷冻保存之前和之后 ，对所有库存测试了支原体。使用两种方法来避免假阳性/负面结果：Lonza mycoalert和Strateragene mycossensor 。所有细胞系对支原体测试了阴性 。
小鼠在Genentech动物设施中饲养在没有特定的无病因条件下。根据《实验动物的护理和使用指南》维护小鼠（国家研究委员会，2011年） 。Genentech是AAALAC认可的设施 ，这项研究中的所有动物活动均根据Genentech机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准进行 。小鼠被安置在维持在14 h – 10 h浅色周期下的动物室内的单独通风笼中。动物室的温度和湿度在68至79°F（20.0至26.1°C）之间 ，分别从30％到70％，每小时10至15室空气交换 。该研究使用了看起来健康且没有明显异常的雄性小鼠（8-12周） 。B6.CG-FOXN1NU/J（000819） ，C57BL/6-TG（CAG-EGFP）1OSB/J（003291）和C57BL/6J（000664）和B6（CG）-IFNAR1 TM1 TM1.2.2EES/J（02828888）鼠标从Jackson购买了。B6.129S6-RAG2TM1FWA N12（RAGN12） ，C.CG/ANNTAC-FOXN1NU NE9（BALBNU-M）和BALB/CANNTAC（BALB-M）小鼠购自Taconic Biosciences 。
cd4.cre.tg rosa26.lsl.tdtomato.cki ot-i.tcr.tg（ot-i - / - 和ot-i+/+），dpt-ires-cre.ert2 。ki.B6N.1C9-1-H4-1_Rosa26.LSL.YFP.cki.B6J_Rosa26.LSL.DTR.cki and E8I.CD8A.IRES.GFP.Cre.tg Rosa26.LSL.tdTomato.cki mice were bred in house.
对于皮下肿瘤接种，将小鼠在100μL的PBS和Matrigel（Corning）的1：1稀释的1：1稀释的1：1稀释液中皮下注入0.5×106 kpp-EGFP细胞。一旦观察到肿瘤 ，观察到小鼠 ，每周至少两次测量肿瘤。根据兽医的指示，如果观察到任何其他不良反应 ，监测频率会增加 ，直到每天的严重性 。如果肿瘤体积超过2,000 mm3，或者肿瘤不超出啮齿动物肿瘤的IACUC指南 ，则立即将小鼠安乐死 。任何表现出其他出乎意料的不良反应的小鼠 ，例如严重的驼背或严重的嗜睡或任何垂死小鼠，都会立即安乐死。至少每周称重小鼠 ，每天称重那些体重> 15％的小鼠 。减轻20％体重的小鼠被安乐死或引起兽医的注意 。身体状况评分为2分或以下的小鼠被安乐死。
e8i.cd8a.ires.gfp.cre.tg rosa26.lsl.tdtomato.cki小鼠进行了治疗 。在每只小鼠的抗小鼠LY6C/g的300 µg中 ，抗小鼠LY6C抗体或来自bioxcell的同种型对照（分别为0075和BE0203）连续3天，在KPP-EGFP邮票肿瘤植入KPP-EGFP邮票之前30天 。为了维持细胞耗竭 ，抗体处理一直持续到研究结束。使用流式细胞仪验证了耗竭 。每天通过GFP/TDTOMATO成像监测肿瘤生长和T细胞浸润 。
每只小鼠用100 µg处理小鼠。抗小鼠CD8B（BE0223）和抗小鼠CD4（BP-0003-3）或同种型对照：（1）C57BL/6J小鼠的CD8和CD4连续3天耗尽了KPP-EGFP邮票4日 。每天通过直接成像随后肿瘤生长 。（2）dpt.ires.cre.ert2.ki.B6N.1C9-1-H4-1_ ROSA26.LSL.YFP.CKI。B6J_ROSA26.LSL.DTR.CKI小鼠连续3天注射抗CD8和抗CD4抗体。14天后（清除抗体）开始了DTP - 二毒素诱导的耗竭实验 。使用流式细胞术证实了所有CD4和CD8耗竭 。
作为DPT表达控制 ，dpt.ires.cre.ert2.ki.B6N.1C9-1-H4-1_ROSA26.LSL.YFP.CKI。B6J_ROSA26.LSL.DTR.CKI小鼠，以前CD4/CD8耗尽，每天注射20 µg ，每只鼠标20 µg 。他莫昔芬 。通过流式细胞仪建立DPT-YFP表达后 ，从KPP-EGFP邮票植入和TDTOMATO+ T细胞重新基础上开始，每隔一天用白喉毒素处理小鼠。使用流式细胞仪验证了耗竭 。每天通过GFP/TDTOMATO成像监测肿瘤生长和T细胞浸润 。
植入了B6.129S6-RAG2TM1FWA N12小鼠 ，用4×106 OT-I - / - TDTOMATO+ T细胞或4×106 OT-I+/+ TDTOMATO+ T细胞植入KPP-EGFP-OVA表达细胞后 ，植入了4×106 OT-I - / - TDTOMATO+ T细胞或4×106 OT-I+/+ TDTOMATO+ T细胞。每天通过GFP/TDTOMATO成像监测肿瘤生长和T细胞浸润
如上所述，将小鼠用邮票微量植入 。将小鼠分配到治疗组中 ，以排除笼子效应 ，并在可能的情况下考虑差异初始肿瘤生长 。肿瘤植入后1天开始治疗免疫缺陷小鼠或肿瘤植入后7天进行免疫能力小鼠。每隔一天用同种型对照抗体（抗GP120;小鼠IgG，3e5 ，3e5 ，10 mg），抗PD-L1（小鼠IgG1 ，6E11 ，6E11，10 mg / kg首次剂量）进行治疗抗TGFβ 。治疗开始后5天，使用M205FA立体镜进行每天对小鼠进行成像 ，×1.0 Planapo镜头（10450028; Leica Microsystems）和Orcaii Digital CCD（Hamamatsu Photonics）监测肿瘤的生长和T细胞的进展 。对于选定的实验 ，将免疫缺陷的小鼠从CD4.CRE.TG_ROSA26.LSL.TDTOMATO.CKI_OT-I.TCR.TCR.TGR.TCR.TGR.TCR.TGR小鼠静脉内注射免疫缺陷小鼠。单个微穆尔单独进行活检或通过表型合并。
KPP-GFP克隆细胞系进行了CRISPR编辑以消除GFP的表达，然后用Piggybac载体转染 ，以表达肿瘤新抗原的decamer肽 ，包括M86 Neoantigen和Cytoplasplasmic mtagbfp2（EF1A_MC38-DECA16-DECA16-CBFP） 。M86 RNA-脂质（RNA-LPX）疫苗是从由Genentech合成的M86编码RNA中组装的，其脂质体与DOTMA和DOPE组成的脂质体以电荷比（+）为：（ - - ）为1.3：2.0 ，为1.3：2.0 ，如前所述 。CD4.CRE.TG ROSA26.LSL.TDTOMATO.CKI T细胞供体小鼠（n = 2）在T细胞分离前使用easysepep小鼠T细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies）在T细胞分离前用M86 RNA-Lipoplex 1 、2和3周对静脉疫苗接种。T细胞用于继承中，转移到RAG2缺陷型小鼠或体外刺激测定中 。为了验证RNA-LPX诱导的抗原特异性T细胞 ，与40,000个表达（+）的肿瘤细胞共培养的疫苗（n = 2）或幼稚（n = 2）小鼠的200,000个脾细胞（n = 2）小鼠是肿瘤新抗原的 。作为阳性对照 ，将M86肽添加到阴性肿瘤细胞中。通过流式细胞仪测量抗原特异性的T细胞刺激，为PD-1+活体CD45+CD90.2+CD8+CD44+CD44+SLAMF7+细胞的百分比 。如在RAG2缺陷型小鼠中所述的4×106 TDTOMATO+ CD3+ T细胞中所述进行的邮票肿瘤测定 ，如以下从接种或幼稚小鼠中所述分离的 。
如下所述 ，将缺乏RAG2缺陷的小鼠静脉注射为0.1×106 kpp-eGFP细胞和4×106 TDTOMATO+ CD3+ T细胞。然后，在静脉注射后8天，将小鼠安乐死 ，并使用27口径针直接将20 ml的冷PBS/肝素5 IU ML-1溶液直接灌注到右心室中 。通过解剖分离肺 ，并使用PBS23中的4％多聚甲醛固定组织 。使用荧光式babb近方法进行组织清除，然后使用配备有白色光线器的SP8显微镜和HCX APO L×20/0.95 Na Imm Lens（Leica Microsystems）获取整个安装图像。使用Imaris软件（BITPLANE）在工作站（Thinkmate）上分析了成像数据 。
从C57BL/6J或CD4.CRE.TG ROSA26.LSL.TDTOMATO.CKI OT-I.TCR.TG（OT-I - / - / - / - 和OT-I+/+）小鼠中分离出T细胞 。在通过70μM细胞滤网过滤之前 ，将脾脏收集并与柱塞的末端从1 ml注射器中分离为10 mL PBS。使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies）分离T细胞进行静脉注射。每只小鼠静脉注射总共4×106个孤立的T细胞 。
为了从OT-I小鼠产生细胞毒性T细胞 ，在包含Gibco RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）的完整培养基中，用10 nM OVA257-264肽（ANASPEC）分离并用10 nm OVA257-264肽（ANASPEC）刺激脾细胞 ，并用10％Gibco febco febco febco calf serum（Thermo Fishco scientific）刺激 。青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific）和50μMβ-甲醇。刺激3天后 ，将细胞重悬于完全培养基中，使用10 IU ML-1重组人IL-2（RHIL-2） 。将细胞毒性T细胞保持在每毫升0.5×106细胞的密度 ，每48小时加入RHIL-2的新鲜培养基 。初次体外刺激后6至8天使用细胞毒性T细胞。
使用1 mM MILTEX无菌无菌一次性活检用柱塞（Integra Biosciences）从肿瘤植入后8或18天的小鼠或模拟植入的对照小鼠的小鼠或模拟植入的对照小鼠进行分离 。将肿瘤在500 µL（邮票微肿块）或3,000 mL（皮下）中消化 ，其中含有0.1 mg Ml-1 DNase I（Roche）和胶原酶D，在1 mg ML-1（Roche）以37°C下的1 mg ML-1（Roche）在1 mg ML-1（Roche）下进行37°C ，以获得单次悬浮液 。
对于表面染色 ，将来自消化的肿瘤的细胞与FC块（5 µg ML -1，BD生物科学，2.4G2）一起孵育 ，并用抗体混合物染色30分钟 ，并活力染料EFLUOR 780（EBIOSCIENCE）。
抗体在1：200稀释时使用 。抗小鼠CD19（B4），抗小鼠I-A/I-E（M5/114.15.2） ，抗小鼠F4/80（BM8） ，抗小鼠/人类CD11b（M1/70）（M1/70），抗小鼠LY-6G（1A8） ，抗小鼠LY-6G（1A8） ，抗Mouse LY-6C（HK1.4），Anti-Mouse cd26（cd2）cd26（cd26）（cd26）（HK1.4） 。（PC61） ，抗小鼠CD4（RM4-5） ，抗小鼠CD62L（MEL-14）和抗小鼠/人类CD44（IM7）抗体购自Biolegend。抗小鼠CD45（30：F11），抗小鼠CD86（GL1） ，CD11C抗小鼠（N418）和抗小鼠CD8A（53-6.7）抗体购自Thermo Fisher Scientific 。抗小鼠CD3（17A2）抗体购自BD Biosciences 。
实时CD45+单细胞细胞子集的门控如下：MHC II+ CD11C+ F4/80-（树突状细胞）或CD103+或CD86+（活化的树突状细胞）；CD11C -CD11B+ F4/80+（巨噬细胞）;CD11b+Ly6g+Ly6cint（中性粒细胞）;CD11b+ ly6glowly6c+（单核细胞）;将CD3+T细胞分为CD3+CD4+T细胞 ，CD3+CD8+T细胞，CD3+CD69+激活/驻留T细胞，CD3+CD44+CD62L-效应器/效应的记忆T细胞或CD3+CD3+CD44 -CD62L+NAIVE T细胞。
使用BD LSRFortessa细胞分析仪（BD Biosciences）收集流式细胞仪数据 ，并使用FlowJo软件（V.10.2; FlowJo）进行了分析。
肿瘤植入肿瘤后8天 ，使用1 mM Miletex无菌可毒式活检打孔器（Integra Biosciences）进行了8天的活检（Integra Biosciences） 。将每个组织活检转移到包含0.25 mL Invitrogen Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific）的单独的1.5 mL管（Eppendorf）中 。活检在Trizol中孵育5分钟，间歇性涡旋。将总共50 µL氯仿（Milliporesigma）添加到匀浆中 ，涡旋20 s ，并在20-25°C下孵育2-3分钟 。为了加速相分离，将样品在4°C下以10,000克离心18分钟 。通过抽吸去除水（顶部）相 ，并转移到干净的1.5 mL管（Eppendorf）中。添加了等于水层体积的100％无RNase乙醇（Milliporesigma）的体积 ，并使用RNeasy Micro Kit（Qiagen）进一步分离RNA 。或者，稍后将单个肿瘤活检浸入RNA中 ，并使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）进一步提取RNA 。
肿瘤植入肿瘤后8天 ，使用1 mM Miletex无菌可毒式活检打孔器（Integra Biosciences）进行了8天的活检（Integra Biosciences）。然后，将3-6个合并的组织活检移至一个预先冷的1.5 ml管（Eppendorf） ，其中包含300 µL消化鸡尾酒 ，该消化鸡尾酒由Gibco RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific），0.1％Gibco胎儿Calum（Thermo Fisher Scientific），0.1％Gibco胎牛血清（Thermo Fisher Scientific） ，0.1 mg mg ml -1 Libere（0.1 mg ml -1 Liberes）（ML -1 Liberes） ，ML -1 drn dne 。（Roche）和32 µM Gibco放线霉素D（Thermo Fisher Scientific） 。将组织在37°C和950 rpm的热水块（Eppendorf）中孵育30分钟，并用移液器机械地每10分钟机械解离。为了消除消化 ，将细胞悬浮液通过40 µm的网格过滤到预先冷的荧光激活的细胞分选（FACS）滤管管中 ，该滤管含有Gibco Fetal Calf Serum（Thermo Fisher Scientific）的淬灭缓冲液（32 µM Gibco actocco actimonycin D（Thermo Fisher）D（Thermo Fisher Scientific） 。将细胞悬浮液以350克离心8分钟，并重悬于400 µL Gibco RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中 ，该悬浮液（Thermo Fisher Scientifitific）用5 µM钙调蛋白蓝色（Invitrogen）（Invitrogen）和1：200的分子探针稀释可固定的可固定的可固定活的活/死活细胞附近的死细胞孔（Thermo dead dead Cell stain kit Kit stain kit stain kit（Thermo themo fishericific） 。进行FACS分析以分离钙调蛋白蓝阳性和L/D近含量细胞中的1.5 mL Eppendorf管 ，其中包含750 µL收集缓冲液，该管子由Gibco RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）组成 ，10％Gibco Calf Calf Serum（Thermo Calf Calf Serum（Thermo Fisher）fishercocibic fisheric fisher delesic actco actinm gcco actinm gcco ，科学）。根据制造商的说明（10X Genomomics），使用双单单细胞小鼠试剂盒5'/TCR确定了在VI细胞XR XR细胞活力分析仪（Beckman Coulter）上确定细胞数和生存能力。
如先前所述 ，将表达人类HER2和胞质GCAMP6的KPP小鼠胰腺癌细胞悬浮在三维胶原蛋白基质中28 。简而言之 ，将大鼠胶原蛋白I（Milliporesigma）的溶液在冰上中性pH上呈中性pH，并与kpp.hher2.gcamp6细胞混合到最终浓度为2 mg ml-1胶原蛋白和1.0×104个细胞 。然后，将150 µL的悬浮液添加到八炉盖玻璃（Cellvis）的单个井中。将腔室在20–25°C孵育15分钟 ，然后在37°C与5％CO2孵育15分钟 。孵育后 ，含有Gibco RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）的500 µL完整培养基，含10％Gibco胎牛血清（Thermo Fisher Scientific） ，2 mM-谷氨酰胺和50 IU ML -1 GIBCO PENICILCILLIN -StICILLICIN -StREPTOMIN -StREPTOMEN -StREPTOMECIN（Theroo Fishercin（Theroo Fisherific）） 。在成像之前 ，允许细胞在胶原蛋白基质中生长5天。
胶原蛋白矩阵中与kpp.hher2.gcamp6 tumouroids相互作用的OT-I T细胞的3D成像在TIE显微镜（Nikon）上使用CSU-X1旋转盘（Yokogawa Electry）和Prime SCMOS摄像头（PlotoMetricts）进行 。八座室成像幻灯片中含有肿瘤细胞胶原蛋白矩阵的介质被带有Gibco RPMI 1640，没有10％Gibco胎儿小腿血清（Thermo Fisher Scientific） ，没有苯酚红（Thermo Fisher Scientific） ，2 mm-谷氨酰胺和50 IU ML -1 Gibco peniciccin（Thermo Fisher Scientific）thermiccin- pripicrcinemcin（prypo）碘化物（Thermo Fisher Scientific） 。根据制造商的协议，将OT-I细胞用CellTrace Farred（Thermo Fisher Scientific）预先标记。将粘贴标记的OT-I细胞添加到包含胶原蛋白悬浮的kpp.hher2.gcamp6肿瘤的每个腔室中 ，并允许在成像之前浸润2小时 。在成像时 ，将T细胞依赖性的双特异性抗体（抗HHE2 ::抗CD3E）以500 nm的最终浓度添加到腔室中，以诱导表达HHE2表达HHER2的癌细胞的细胞毒性T细胞识别 。在控制条件下 ，未添加抗体。
带有MTAGBFP2的TDTomato+ CD3+ T细胞的RAG2缺陷小鼠和表达GCAMP6表达KPP的KPP邮票微肿块的含量为lurane摄效 ，并从肿瘤植入后15天到相同的耳朵植入后的15天到每天成像 。每天在相同的耳朵区域获取落叶延时显微镜图像序列，其中×1.0 Leica Planapo物镜（Leica 10450028）在Leica M205 FA卵荧光立体显微镜上，每分钟60-70分钟 。使用Imaris（Bitplane）进行图像分析。肿瘤植入后8天的单个肿瘤的延时图像系列被半自动分割 ，并分析时间点之间的Ca2+流入。此外 ，分析了肿瘤大小，T细胞丰度和T细胞浸润 。对肿瘤植入后13天的单个肿瘤的延时图像序列进行半自动分段 ，并分析肿瘤大小 ，以确定从第8天到第13天的肿瘤生长 。
缺乏MTAGBFP2和表达GCAMP6表达KPP的KPP邮票的FOXN1缺乏的裸鼠通过异氟烷吸入效果，并在肿瘤植入后12天通过异氟烷吸入效果 ，使含有mTAGBFP2和GCAMP6表达KPP的KPP邮票的TDTOMATO+ CD3+ T细胞进行了麻醉。使用两光子激光扫描显微镜（Ultima Intima In Bruker Technologies ，Bruker Technologies）每90 s获取45分钟的图像序列，并通过双Ti：Sapphire Lasers（Maitai DeepSee ，Spectra ，Spectraics，Spectraics）对830 nm和980 nm和980 nm ，a a a a a a s a×16/a a×16/a ac s a×16/a a×980 nm ，spectrage inter-ti-nm，sapphire Lasers（Maitai deepsee，spectra）进行交替激发 。（尼康） 。此后 ，静脉注射（每千克6 mg）给予T细胞依赖性双特异性抗体（抗HHE2 ::抗CD3E） ，并在同一区域继续进行多光子延时显微镜图像获取。单个肿瘤的延时图像系列用imaris（bitplane）半自动分割，并分析时间点之间的Ca2+涌入 。
在2018年1月至2020年3月之间 ，从IMCore29配对活检试验（NCT0333655）中招募的患者获得肿瘤活检 。这项研究是一项持续的 ，开放标签的，多中心试验 ，于2018年2月启动 ，并在全球进行了全球研究中心，包括美国 ，法国 ，法兰西州和Spain。成人转移性癌症或血液学恶性肿瘤患者在癌症免疫疗法上表现出临床益处，并且在基线时进行肿瘤活检（治疗前/档案）和进展时都有资格纳入 。癌症免疫疗法包括销售药物（包括针对CTLA-4 ，PD-L1或PD-1的剂量） ，或通过参加Roche/Genentech CPI临床试验而管理的药物 。具有最佳总体反应的患者（基于实体瘤v.1.1的反应评估标准）的完全反应，部分反应或稳定疾病> 6个月后（如果以较早的协议版本招募，则> 3个月）符合条件。panck/cd8双重染色是对基线和福尔马林固定石蜡包含的肿瘤样品的组织学切片进行的 。免疫表型由病理学家（Histogenex）使用定义的标准30确定 。
临床试验注册如下：IMVigor210（NCT02951767/NCT02108652） ，ICON7（NCT00483782）和IMCORE试验（NCT03333655）。对于ICON7和IMVIGOR210研究 ，可以在https://clinicaltrials.gov/上获得完整协议。对于IMCORE试验，可以根据要求获得该协议（www.roche.com/about_roche/roche_worldwide.htm ，+1 888-662-6728 ，全球 - roche-genentech-trials@trials@gene.com） 。对于IMVigor210试验，该研究得到了每个参与地点的独立审查委员会的批准 ，并完全符合赫尔辛基宣布和良好的临床实践指南的规定 。在研究开始之前 ，获得了机构伦理委员会或机构审查委员会的批准，并在致调查员的信中记录了委员会开会并获得批准的日期。ICON7方案符合良好的临床实践指南和赫尔辛基的宣言 。在全国或两者兼有伦理委员会的批准 。对于IMCORE试验 ，研究方案在入学机构和地方伦理委员会（Wirb Sarah Cannon Research Institute; Iuct uch oncopole oncopole toulouse; Clinica di Navarra ，西班牙）批准了研究方案。
ICON7和IMVIGOR210试验先前已发表11,13 。对于IMCORE试验，如果满足资格标准（包括检查点抑制的临床益处和活检 ，则可以在同一组织治疗之前和之后获得参与机构 ，请通过参与机构招募患者 。在招募时，尚无免疫表型的了解，因此限制了潜在的偏见。补充表7中总结了IMCORE患者的临床特征 。
所有患者均提供了书面知情同意 。
创建了一个与肿瘤相关的MTAGBFP2荧光的等值面。计算MTAGBFP2和GCAMP6荧光像素强度的总和 ，每个时间点的肿瘤等值位 。计算连续时间点之间的总和荧光强度的绝对三角洲 ，为每个荧光团平均，并标准化为相应的平均荧光强度（MFI） 。CA2+涌入指数是将归一化GCAMP6强度的归一化的平均增量总和除以MTAGBFP2强度的归一化平均增量和的结果。
创建了一个与肿瘤相关的MTAGBFP2荧光的等值面。对于每个时间点 ，确定了与T细胞相关的TDTOMATO荧光的MFI 。T细胞丰度指数是计算所有时间点上TDTOMATO MFI的中位数的结果 。
创建了一个与肿瘤相关的MTAGBFP2荧光的等值面。使用肿瘤等表表面 ，定义了两个新区域：肿瘤中心（肿瘤的50％）和肿瘤周围（肿瘤周围的区域，距肿瘤边界距离高达50 µm） 。确定与T-Cell相关的TDTOMATO荧光的MFI在肿瘤中心和每个时间点的肿瘤周围确定 ，并计算了所有时间点上MFI的中位数 。T细胞浸润指数是这些中位数（中心/外围）比率的结果。
创建了一个与肿瘤相关的MTAGBFP2荧光的等值面 。对于每个时间点 ，计算了MTAGBFP2和GCAMP6荧光像素强度的总和 。计算连续时间点之间的总和荧光强度的绝对三角洲，为每个荧光团平均 ，并在所有时间点上归一化为相应的MFI。GCAMP6强度的归一化平均增量总和除以MTAGBFP2强度的归一化平均增量总和（value1） 。另外 ，平均S.D.在整个时间序列中计算出每个像素的MTAGBFP2和GCAMP6荧光 。平均S.D.GCAMP6的平均S.D.mtagbfp2（value2）。Ca2+涌入指数（两光子）是乘以值1和Value2的结果 。
创建了与肿瘤相关的GCAMP6背景荧光相匹配的等图 。为每个时间点计算了针对肿瘤细胞等速膜的GCAMP6 MFI的中值。计算和平均连续时间点之间中位小额信贷机构的绝对三角洲。Ca2+流入指数（旋转盘共聚焦显微镜）是将平均DELTA中位GCAMP6 MFI除以所有时间点的平均GCAMP6 MFI的结果 。
创建了与肿瘤相关的GCAMP6背景荧光相匹配的等图 。计算每个时间点的肿瘤细胞等膜的丙啶MFI的中值。计算和平均连续时间点之间中位小额信贷机构的绝对三角洲 。碘化丙啶的涌入指数是将平均碘化丙肽中位数iodide mfis除以所有时间点的平均碘化丙酰基MFI的结果 。
使用自定义的斐济脚本将肿瘤荧光图像进行了分组，并将其调整为512×512 PX。用1 =肿瘤手动生成二进制（两级）掩模 ，0 =背景 。根据https://github.com/zhixuhao/unet进行了张紧的U-NET模型 ，在595个配对图像的数据集上进行了培训，该数据集具有蒙版（70％的培训和30％验证）的7个时期，直到该模型因培训的准确性而超过验证精度而无法准确地表明 ，该模型开始拟合过度过高 。
使用自定义的斐济脚本将肿瘤荧光图像进行了分组 ，并将其调整为512×512 PX。初始分割猜测是通过使用TensorFlow应用训练的U-NET来生成的 。自定义斐济脚本用于解开肿瘤分割，以恢复原始大小和分辨率 ，启用所有肿瘤分割面罩的手动审查和编辑 ，并通过多个时间点手动跟踪肿瘤 。如果在实验过程中不再检测到肿瘤，则指定为完整的响应者。如果肿瘤的最大尺寸减少了20％或以上 ，则将其指定为部分响应者 。其余肿瘤被指定为稳定的疾病和进展疾病 。
自定义斐济脚本用于识别每个感兴趣的肿瘤区域的质心和车制直径 ，并确定T细胞荧光通道的中间径向荧光谱。自定义Python脚本用于确定总体中位T细胞荧光强度，并将径向荧光曲线分类为沙漠 ，排除或发炎。肿瘤被分类为使用比率截止的排除或发炎 。如果肿瘤内部25％内的径向谱始终大于该肿瘤最大荧光的60％ ，则被指定为发炎 。如果肿瘤内部25％内的径向谱始终小于该肿瘤最大荧光的40％，则被指定为排除。如果单个肿瘤的中值T细胞荧光强度小于第一个成像日测量的所有肿瘤的中位数中位数中位数中位数的中位数中位数的中位数中位数中位数的25％ ，并且径向谱并未表明如上所述的排除模式 。如果肿瘤根据比率标准显示出排除的曲线 ，但是肿瘤核心的T细胞强度（内部25％）大于所有发炎肿瘤的中位T细胞强度，则将其重新分类为发炎 。如果肿瘤不符合上述比率截止，则表型确定前一天是向前传播直到下一个确定分类的。
自定义Python脚本用于为T细胞表型分类分配一个整数值 ，其中1 =沙漠 ，2 =排除，3 =发炎 。如果将小鼠安乐死 ，则将剩余的时间点分配为0 。如果肿瘤解析 ，则将剩余的时间点分配为5。肿瘤轨迹是通过肿瘤表型清单的层次聚类来排序的 。根据该表型聚类，对肿瘤区域 ，中位细胞浸润和肿瘤生长的随后热图进行了排序 。使用自定义Python脚本生成了Markov分析的过渡状态矩阵。为了评估显着性 ，使用python随机分配表型态被随机分配十倍 。
自定义python脚本用于计算浸润比，其中分子是肿瘤核心的中值强度（内部25％） ，而分母表示中位径向谱的最大值 。相对于总T细胞丰度绘制了这些值 ，并在跨时点进行了比较。
为了排除可以通过在KPP-EGFP细胞系中预先存在的主要亚克隆来解释TIP的可能性，肿瘤细胞系遗传异质性是在植入前使用全外活体测序评估的 ，植入后3周。实验中使用的野生型小鼠菌株的脾样品用作参考匹配的正常基因组 ，以在肿瘤细胞中进行变异 。肿瘤植入后的分析仅限于在KPP-EGFP细胞系中检测到的肿瘤变异，以减轻从不同活检的不同TME成分捕获的小鼠中任何潜在的遗传变异性的影响 。
在HISEQ 2500（Illumina）系统上测序了外显子捕获库，以生成2×75 bp配对的数据；从测序的读取中 ，使用以下工作流来调用变体。测序读数使用设置为默认参数的BWA Software31映射到UCSC鼠标基因组（GRCM38） 。根据GATK最佳实践进行本地重新调整 ，重复标记和原始变体调用32 。使用Strelka33对肿瘤及其匹配的正常BAM文件进行的体细胞变体。
所得的变体可以解释为对宿主小鼠基因组中存在于KPP-EGFP细胞系中存在的外显子组中的遗传差异的描述 。这种测量的粗粒在人口的克隆结构上；然而，对所得变体等位基因频率直方图的检查可以告知潜在的子克隆 。对于植入前细胞系样品 ，用直方图总结了变体等位基因频率。在这些表示中未观察到主要的子克隆 。但是 ，正如预期的那样，有较小变体的证据 。这些是潜在的中性次要亚克隆 ，在培养实践中不可避免地 ，例如单细胞亚克隆后的扩张阶段。为了证明，这种次要子克隆的低频尾巴符合人群中突变体的中性积累 ，直方图的左尾尾是使用R package natipationalticaltestr（https://github.com/marcjwilliams1/neutralitytester）适合中性模型 。对于植入后的肿瘤样品 ，检测到一些潜在的变异，因为它们始终存在于免疫感染的 ，免疫排除或免疫 - 脱骨的肿瘤中 。为了排除由于算法设置和每个样本的测序深度而丢失的变体 ，通过检查读取映射到使用集成基因组观看器在其余样品上检测到的变体的区域，手动策划了有问题的变体。因此，我们证实 ，在免疫表型的48种潜在解释性变异中 ，除了其他样品外，所有这些变体都被检测到了。缺失的变体是一种非常低频的变体 ，可以通过未达到其他肿瘤样品中的检测极限来解释 。
使用HTSEQGENIE管道在BioConductor34中分析了每个RNA-Seq实验 ，如下所示：首先，以低核苷酸质量（70％的质量<23的碱基的70％）或与RRNA和适配器序列的匹配进行读取 。使用GSNAP（v.2013-10-10 -V2）将其余读取与鼠标参考基因组GRCM38.P5对齐 ，允许每75个基本序列最多两个不匹配（参数：'-m2 -n 10 -b 2 -b 2 -b 2 -i 1 -i 1 -n 1 -n 1 -w 200000 -e 1 -w 200000 -e 1 -e 1 -e 1 -e 1 -e 1 -e 1 -pairmax -rna = 200000 -clip -clip -clip -clap -clap -clap -’ -clap -’’）。转录本注释基于Gencode基因数据库35 。为了量化基因表达水平 ，计算了明确地映射到每个基因外显子的读取数量 。
使用EDGER软件包（v.3.32.1）在R（V.4.0.5; 2021年3月31日）中分析了所得计数矩阵。通过将特征至少为0.2计数（CPM）保持超过实验组的最小数量，鉴于被分析的设计因子 ，计数矩阵被过滤以去除低表达基因 。然后将所得的过滤计数矩阵对数转换并使用EDGER :: CPM（log = T）和EDGER :: CalcNormFactors（方法=“ TMM”）进行对数分析 。将矩阵进一步过滤到使用投影得分36选择的最可变基因 ，以关注转录状态方差的主要贡献者。然后，使用base：scale（）进行后验探查 ，对此矩阵进行缩放 。基因本体论（GO）术语注释的所得数据矩阵的热图是通过首先聚集基因 ，然后使用clusterProfiler（v.3.18.1）进行富集分析来构建的，以选择与上述杂物相关的最重要的GO术语（我们的脚本也允许US WikiPathways和kegg和kegg） 。为了了解样品在转录状态下的一般聚类，使用PCATOOLS（https://github.com/kevinblighe/pcatools; v.2.5.15）进行了使用主成分分析的缩放矩阵的维度降低。
使用Limma（V.3.46.0）37进行差异表达分析 。为了检测免疫表型之间的特征差异 ，我们的对比比较了手头的免疫表型与其他两种的平均值 。使用软件包增强volcano（https://github.com/kevinblighe/enhancevolcano; v.1.8.0）构建了火山地块。基因集富集分析是对差异表达对比的对数转换的折叠变化进行的 ，该对比使用了Hallmark Gene Set Collection 38上的clusterProfiler的GSEA函数。如果途径的错误分离率调整后的P值小于0.2，则认为途径很重要 。对临床试验RNA-seq数据进行了相同的分析 。为这些重要途径构建了归一化富集评分的热图。对于进一步研究的特定途径 ，使用组成的基因的表达矩阵的第一个主要成分进行了样品 ，该基因的第一个主要成分乘以组件相关性与所有签名基因的样品平均表达的符号 。对于时间序列实验，从Hallmark Gene Set Collection提取了I型干扰素签名 。
使用CellRanger Count（CellRanger v.4.0.2的10倍基因组学）处理SCRNA-SEQ FASTQ文件 ，使用基于鼠标基因组GRCM38的自定义参考 ，其中gencode35基因模型以及我们实验中使用的转基因的序列（TDTOMATOMATOMATOMATONENG）（TDTOMATOMATOMATONAND GFP）。同样，使用CellRanger VDJ处理TCR测序数据 。
使用Seurat39（V.4.0.4）在R（V.4.0.5; 2021年3月31日）中对计数矩阵进行了分析 。仅保留高质量的细胞进行后验分析。更具体地说 ，我们保留了检测到30000多个基因的细胞 ，超过1,000个唯一的分子标识符和小于10％的线粒体读数 。为了简化我们的分析，将TDTOMATO+细胞（收养T细胞）和GFP+细胞（KPP肿瘤细胞）分开并独立聚集 。将其余细胞聚集以构建用于邮票肿瘤的地图集。在这两种情况下 ，在Seurat的Sctransform管道之后 ，进行了细胞群的聚类和鉴定 。首先，使用Seurat :: Sctransform（）进行细胞周期回归和批化校正，将数据归一化 。然后使用距离图40计算保留用于聚类的主组件的数量。使用这些保留的组件 ，我们随后计算了一个UMAP嵌入和邻居进行后聚类。计算了几种聚类分辨率 ，并构造了一棵有向树，以反映了增加分辨率41后新簇的层次关系 。如果没有打破所述树的层次结构 ，则认为该决议是最佳的 。主要簇是通过已知生物学的表达标记来鉴定的。然后 ，对于每个主要的细胞群集，通过迭代上述管道进行第二次群集 。值得注意的是 ，此步骤使我们能够识别细胞种群中的异质性并进一步去除低质量的细胞 。使用Seurat :: FindAllmarkers（）方法鉴定了每个群集的标记 ，并使用默认参数进行了比较，将特定簇中的所有单元格与其他单元格进行了比较 ，并使用Wilcoxon的Rank-SUM测试和Benjamini-Hochberg校正访问了显着差异基因表达。
我们将Seurat的绘图功能用于大多数图 。使用seurat ::平均expression（）函数在缩放到每个基因相对表达后使用z得分的seurat ::平均expression（）函数的结果 ，使用knepure expression（）函数生成制造商热图 。使用seurat :: findmarkers（）进行差异表达分析，批次作为潜在变量和负二项式测试。我们报告了使用ComplectHeatMap的Z评分尺寸矩阵 ，报道了重要的基因对数转换的倍数变化值 。使用scretpertoire软件包（v.1.0.0）进行了克隆型分析和与Seurat的集成 。根据其TCR氨基酸序列调用clonotypes。对seurat :: findmarkers（）的对数转换的倍数变化值的基因集富集分析进行了对cC本体学集合中的clusterProfiler r套件的gsego（）函数进行比较与排除的表型的比较 。
为了证明在体外的KPP-EGFP细胞系的转录异质性与体内免疫表型之间缺乏确定性相关性 ，对植入之前和之后的细胞系的成对样品进行了单细胞测序 。用抗体将肿瘤用细胞刺，然后在测序前合并。使用Seurat :: Htodemux（）（）和Doublets和负细胞在Hashing抗体计数上进行中心对数比率的归一化后，将样品解散。然后根据与邮票地图集相同的管道处理并按照相同的管道进行处理并聚集了细胞锤样品和体外植入单细胞对象 。最后 ，将体外簇植入前簇连接到体内簇 ，并在带有体外簇作为参考的体内细胞上通过运行Singler（V.1.8.1）预测的标签（V.1.8.1） 。然后，将预测的标签用于使用ggalluvial（V.0.12.3）构建冲积图。
如图传奇所示 ，使用两尾t检验 ，曼•惠特尼U检验或对数秩检验进行统计分析 。P <0.05被认为具有统计学意义 。所有盒子和晶须图都划分了中位数（中心线），第75个和第25个百分位数（分别为上限和下限） ，以及最小值和最大值（不包括确定为离群值的点数）超过1.5倍 ，超过1.5×四分位间距（Whiskers）。条形图代表平均值±S.D.或平均±S.E.M.如所示 。图例中提供了每种条件的小鼠，肿瘤和细胞数 。使用GraphPad Prism（V.9.4.1）或Python（v.3.10.3）使用Scipy（V.1.8.0）进行统计分析。使用FlowJo（V.10）进行流式细胞仪分析 。图2所示的成像实验 。1a ，2a ，f，g和3d ，h和扩展数据图。1a – c ，2b，e，g ，3c ，e，f ，6a ，b，f ，f ，h，m和9a ，e ，e描绘了代表性图像，定量是所示的生物复制的骨料 。小鼠实验可靠地再现 。除非传说中另有说明 ，否则将实验独立复制至少两次。没有使用统计方法来确定样本量。治疗前小鼠是随机的 。调查人员并未对分配视而不见 。对治疗实验进行了盲目的高吞吐量分析。由于需要跟踪单个肿瘤活检并以相似特征（小鼠的基因型 ，免疫表型，时间）来填充它们，因此未对NGS和流式细胞仪分析进行盲目盲目 。对于所有实验 ，分析都是客观的 。
所有数据都用Adobe Illustrator 2022。使用Biorender（https://biorender.com/）创建1A ，2C和3G 。R图与GGPLOT2（v.3.3.5），GGPUBR（V.0.4.40）和Confffer -HeatMap42（v.2.6.2）软件包一起使用了上述软件包的本机绘图功能 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
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文章不错《原位肿瘤阵列揭示了癌症免疫的早期环境控制》内容很有帮助