仅靶结构的蛋白质结合蛋白设计

　　HA（蛋白质数据库（PDB）标识符：4FNK）25，EGFR（PDB：1MOX：1MOX ，4UV7）17,42
，PDGFR（PDB：3MJG）18，IR（PDB：PDB：4ZXB）19 ，IGF1R（PDB：PDB：PDB：5U8R）20
，tie 2（PDB：PDB：2B），（PDB：3DI3）22 ，CD3（PDB：1XIW）23
，TGFβ（PDB：3KFD）24和VirB8（PDB：4O3V）26在受实验衍射数据约束的Rosetta能量场中进行了完善。用Rosetta Fastrelax协议改进了TRKA（PDB：1WWW）15（PDB：1WWW）15（PDB：1EV2）16的晶体结构，并具有坐标约束 。提取目标链或所选靶向区域 ，并将其用作对接和设计的起点
。为了运行PatchDock11，首先将脚手架突变为聚谷
，并使用默认参数来生成原始码头。利福多克用于通过将数十亿个分散的氨基酸停靠到所选靶向区域6 。详细说明，疏水侧链R组使用分支和结合的搜索对准目标 ，以快速识别与目标的有利相互作用
，并且极地侧链R组在每个目标氢键捐赠者或受体周围列举采样
。为了识别可以从中进行这些相互作用的主链放置位置，用于所有R组放置的侧链旋转构象都会向后生长 ，并且它们的骨干坐标存储在六维的空间散布表中
，以进行快速查找。对于层次搜索协议，使用分支和结合的搜索算法从低分辨率的空间网格到高分辨率空间网格 ，将微动蛋白支架库（长度为50-65个残基）停靠到逆旋转旋转器的场中 。对于PatchDock+Rifdock协议
，将PatchDock输出用作脚手架初始定位的种子， 码头进一步完善了最好的分辨率RIF
。这些对接构象进一步优化 ，以使用Rosetta FastDesign方案生成形状和化学互补的接口
，从而在侧链旋转旋转器优化和基于梯度的能量最小化之间激活。将服务改进添加到序列设计方案中，以生成更好的折叠和结合序列 。其中包括一种更好的排斥能量促进策略9 ，上升的跨界面能量，伪能项惩罚埋葬的不满足的极性原子13和基于天然蛋白质片段的序列曲线约束12。最终设计模型的计算指标是使用Rosetta计算的
，Rosetta包括DDG，Shape互补和界面埋入SASA ，触点分子表面等
，以进行设计选择
。所有用于运行程序的脚本和标志文件都在补充信息中提供。 　　计算所有连续二级结构基序（螺旋，链和环）的结合能和界面指标 ，用于在广泛搜索阶段生成的设计 。提取具有良好相互作用的基序（基于结合能和其他界面指标
，例如SASA和接触分子表面），并使用目标结构作为参考提取并对准目标
。然后根据基于能量的-tmalign样聚类算法将所有基序聚类。简而言之 ，所有基序都是基于与目标的相互作用能量进行分类的
，而未簇的池中最低的能量基序被选为第一个群集的中心 。根据Tmalign算法43计算了该基序和剩余池中的每个基序之间的分数相似，而没有任何进一步的叠加
。从当前群集中心中删除了阈值相似的分数（默认为0.7） ，从未聚集的池中删除了这些图案
，并添加到了新集群中。选择未聚集的池中剩余的最低能量图案作为下一个群集的中心，然后重复第二步 。此过程一直持续到随后的簇 ，直到未保留在未聚集的池中的图案为止
。然后，根据每个位置加权的Rosetta结合能从每个群集中选择每个群集的最佳基序
，使用每个位置的所有对齐基序中的平均能量作为权重。选择了大约2,000个最佳图案，并使用Motifgraft Mover44将脚手架库叠加到这些图案上 。界面序列是未来优化的 ，并为广泛搜索阶段所述的最终优化设计计算计算指标
。生产100,000个设计的粘合剂的CPU时间要求通常约为100,000个CPU小时（通常至少是计算设计的数量的至少十倍）。 　　对接方法（步枪和集中搜索）与随后的完整序列设计步骤之间存在严重的速度不匹配 。尽管对接方法通常每1-3 s每1-3 s产生输出
，但整个序列设计可能需要超过4分钟。为了解决这种情况，一个步骤的设计要比在RAW码头上评估的指标更具预测性 ，但比完整的序列设计更快
。 　　Rosetta beta_nov16得分函数的剥离版本仅用于使用疏水氨基酸设计。具体来说
，FA_ELEC，LK_BALL [ISO ，BRIDGE
，BRIDGE_UNCLP]和_INTRA_术语被禁用，因为这些术语被证明是通过分析的最慢的能量方法 。剩下的都是Lennard-Jones ，隐式溶剂化和骨干依赖性的一体能量（FA_DUN
，P_AA_PP，RAMA_PREPRO）
。此外 ，使用标志来限制在每个位置建造的旋转量（补充信息）。 　　在快速设计步骤之后，两次设计将设计最小化：一次具有低抑制分数函数
，并且再次具有正常的抑制分数函数 。然后评估了感兴趣的指标，包括Rosetta DDG ，接触分子表面以及与关键的疏水残基的接触分子表面
。 　　基于这些预测指标与完整序列设计后的值相关的观察结果
，使用了最大似然估计器（类似于逻辑回归的功能形式），以使每个预测的设计都应该选择它以前进。要评估的码头的一个子集经过完整的序列设计 ，并计算了其最终度量值 。对于每个过滤器的目标阈值
，每个全面设计的输出都可以标记为通行证，也可以独立为每个度量标准标记
。然后 ，通过通过快速轨迹的值来捆绑所有设计的输出
，并绘制通过目标阈值的设计的比例，每个预测的设计都可以计算每个滤镜的概率（拟合sigmoids以使分布平滑）。从这里开始 ，可以将每个过滤器传递的概率乘以将所有过滤器的最终概率乘在一起 。然后
，可以使用此最终概率对设计进行排名，并选择最佳设计 ，以向前迈进，以进行完整的序列优化
。 　　请注意
，此处的快速设计协议仅用于对设计进行排名，而不是优化它们。原始的 ，非拉皮设计的码头是向前携带的结构 。 　　SASA是对氨基酸暴露于溶剂的量度
，通常使用涉及球形探针的计算机滚动的方法计算，该方法近似于水分子（半径1.4Å） ，围绕全原子蛋白模型。蛋白质 - 蛋白质结合后的三角肌已被广泛用于分析天然蛋白质相互作用
。与天然蛋白质复合物的晶体结构不同
，从头相互作用的设计模型通常不完美地包装，并包含许多孔或空腔。如果界面中的孔或空腔的尺寸小于滚动探头 ，则SASA无法捕获这些孔和空腔
，而Delta-SASA度量通常会高估真实的接触 。开发了接触分子表面，以减轻从头设计的相互作用的缺陷
。首先 ，使用Rosetta形状互补过滤器中的三角化算法计算粘合剂和靶的分子表面。对于每个三角形
，计算到另一侧最接近三角形的距离，并使用以下公式将三角形的面积减小：a'= a×exp（-0.5×distain2） 。然后 ，将所有向左的区域求​​和以获得接触分子表面
。这样，目标与粘合剂之间的实际接触会受到界面中的空腔和孔的惩罚。接触分子表面被用作Rosetta大分子建模套件中的接触分子表面滤波器 。 　　Rosetta序列设计从生成相互作用图开始
，通过计算所有可设计的Rotamer Pairs45之间的能量
。通过优化蛋白质的总能量（单体/复合物），使用蒙特卡洛模拟退火方案搜索了最佳的旋转体组合。为了获得粘合剂和靶蛋白之间的更多接触 ，我们可以通过定义的因子上升所有跨界面旋转旋转对的能量 。这样
，蒙特卡洛协议将有偏见以找到具有更好的跨界面相互作用的解决方案
。在Rosetta大分子建模套件中，实现了上升蛋白接口的交互协议作为蛋白质互动的任务操作。 　　使用RosettAscript协议设计了1,000台螺旋支架的最高30个PatchDock输出 。rifdock播种 ，用斑点输出播种
，每个支架产生了300个输出，将预测器（方法）和随后设计的总计为19,500个码头。每个脚手架的前150个步枪输出被修剪为9,750 ，设计了300个图案
，并提取了300个图案
。将图案嫁接到脚手架中，以生产150,000个码头 ，将其修剪至9,750
，并与早期的9,750结合使用。 　　通过在设计的羧基末端添加（GGGS）N连接器，将所有蛋白质序列填充到65个氨基酸中 ，以避免PCR反应期间短DNA片段的偏置扩增 。使用Dnaworks2.0（参考文献46）用酿酒酵母密码子频率表对蛋白质序列进行了翻译和优化
。编码从头设计和点突变库的寡核苷酸池购自Agilent Technologies。组合库以集成的DNA技术Ultramers购买，最终的DNA多样性范围从1×106到1×107 。 　　使用KAPA HIFI聚合酶（KAPA Biosystems）使用QPCR机器（Bio-Rad
，CFX96）扩增所有库
。详细说明，首先在25μl反应中放大了库 ，并在反应达到最大产量的一半以避免过度放大时终止PCR反应。将PCR产物加载到DNA琼脂糖凝胶上 。切除具有预期尺寸的带
，并使用Qiaquick套件（Qiagen）提取DNA片段
。然后，将DNA产物像以前一样重新扩增 ，以产生足够的DNA以进行酵母转化。最终的PCR产品使用Qiaquick清理套件（Qiagen）清理 。对于酵母转化步骤
，使用先前描述的方案47将2-3 µg线性化的修饰PETCON载体（PETCON3）和6 µg插入物转换为EBY100酵母菌菌株
。 　　使用相同的PCR方案制备了用于深度测序的DNA文库，除了通过Zymoprep从5×107到1×108细胞制备的酵母质粒开始的第一步（Zymo Research）。在第二个QPCR步骤中添加了Illumina适配器和6 bp池特异性条形码 。凝胶提取用于获取用于测序的最终DNA产物。使用Illumina NextSeq测序对所有不同的分类池进行了测序
。 　　如前所述25,48 ，使用杆状病毒表达系统表达了流感A HA外生域。简而言之
，每个HA都与氨基末端的GP67信号肽融合，并在C末端的Bira Biotinylation位点 ，凝血酶裂解位点
，三聚化域和HIS-TAG融合 。使用Ni2+-NTA树脂的金属亲和色谱法纯化表达HA
。为了结合研究，每种HA都用BIRA生物素化 ，并使用S200 16/90列在äkta蛋白纯化系统（GE Healthcare）上通过凝胶过滤纯化。生物素化反应含有100 mM Tris（pH 8.5），10 mm乙酸镁
，10 mM ATP，50 µM生物素和<50 mM NaCl ，并在37°C下孵育1小时 。 　　对于TRKA
，将编码人类TRKA细胞外域（ECD）（残基36-382）的DNA克隆到PACBAP中，PacBap是PACGP67-A的衍生物 ，以遵守6×××perifitifut
。然后
，使用Baculogold baculovirus表达系统（BD Biosciences）将其转染到毛状体（高五个）细胞（Invitrogen）中进行分泌，并从Ni-NTA通过澄清的上清液中纯化 ，然后用尺寸 - 分类色谱（SEC）用Superdex-2000列中的Superdex-ex-ex-exex-extile Plomotograpty（sec）中的superdex-ex-ex-ex-ex-ex-ex-excco pbs（sec-ex-ex-ex-execco pbs（sec）纯化。The ectodomains of FGFR2 (residues 147–366, UniProt ID: P21802), EGFR (residues ID 25–525, UniProt ID: P00533), PDGFR (residues 33–314, UniProt ID: P09619), IR (residues ID 28–953, UniProt ID: P06213),IGF1R (residues 31–930, UniProt ID: P08069), TIE2 (residues 23–445, UniProt ID: Q02763), IL-7Rα (residues 37–231, UniProt ID: P16871) were expressed in mammalian cells with a IgK signal peptide (METDTLLLWVLLLWVPGSTG) at then Terminus和C末端标签（gsenlyfqgshhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhheqkiewhe）
，其中包含一个TEV裂解位点，一个6 his标签和一个Avitag 。如前所述26 ，在带有C末端AVITAG的大肠杆菌中
，ViRB8表示
。蛋白质通过Ni2+-NTA纯化，并通过秒抛光。然后按照制造商的协议 ，用BiRA生物素 - 蛋白连接酶散装反应试剂盒（Avitag）蛋白质将AVITAG蛋白化为生物素，并通过SEC去除过量的生物素 。生物素化的CD3蛋白购自ABCAM（AB205994）
。TGFβ购自Acro Biosystems（TG1-H8217）。IGF1购自Sigma（407251-100μg） 。胰岛素购自ABCAM（AB123768）。如前所述制备了笼子Ang1-Fc蛋白
，并由G. ueda提供
。FI6V3抗体由D. H. Fuller（华盛顿大学）提供。 　　酿酒酵母EBY100应变培养物在补充2％（w/v）葡萄糖的C-TRP-ura培养基中生长 。为了诱导表达，将酵母细胞以6,000克离心1分钟 ，并在补充0.2％（w/v）葡萄糖的SGCAA培养基中以每mL 1×107细胞的细胞密度为单位
，并在30°C诱导16-24 h
。用PBSF（具有1％（w/v）BSA）的PBS洗涤细胞，并使用两种标记方法用生物素化靶标标记：具有避免性且无避免标记。对于持续方法 ，将细胞与生物素化靶孵育
，并与抗C-Myc荧光素异硫氰酸酯（FITC，Miltenyi Biotech）和链霉亲和蛋白蛋白 - 腓果蛋白（Sape ，Thermofisher）一起孵育 。在生物素化靶标的浓度的四分之一中使用了SAPE中的SAPE浓度
。对于没有避免方法的方法
，首先将细胞与生物素化靶标一起孵育，并用SAPE和FITC进行洗涤和次要标记。所有从头设计的原始文库均使用与避免性方法的前几轮筛选一起对排除弱粘合剂候选者进行排序 ，其次是几种没有不同浓度的目标 。对于SSM文库
，应用了两轮没有避免性的行为，并且在第三轮筛选中 ，库被用一系列降低的靶标降低，以富集具有有益突变的突变体
。通过将目标浓度降低到随后的排序中
，并仅收集结合群体的最高0.1％，将组合文库分类为收敛。组合文库的最终排序池被铺在C-TRP-ura平板上 ，并通过Sanger测序确定单个克隆的序列 。竞争排序是按照没有持续的协议进行的
，并进行了较小的修改
。简而言之，生物素化靶蛋白（H1 ，H3
，TRKA，IR ，IGF1R
，PDGFR和TIE2） 首先与过量竞争者（FI6V3，FI6V3 ，NGF
，胰岛素，IGF1 ，PDGF和CAIGENG ANG1-FC）一起孵育10分钟，并将混合物用于标记细胞。如前所述50
，使用该方案制备非特异性试剂 。对于非特异性排序，首先将细胞用PBSF洗涤 ，并与非特异性试剂以100μgml– 1的浓度孵育30分钟。然后将细胞洗涤
，然后用SAPE和FITC标记用于细胞分选
。然后使用上述方案将单元格用RBD标记。 　　将编码设计蛋白质序列的基因合成并克隆到修饰的PET-29b（+）大肠杆菌质粒表达载体（Genscript，N端8-His TAG ，然后是TEV裂解位点） 。对于所有设计的蛋白质
，N末端标签的序列是Mshhhhhhhhhhhhsenlyfqsggg（除非另有说明），然后立即是设计蛋白的序列
。对于用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签表达的蛋白质 ，将相应的基因亚克隆到改良的PET-29b（+）大肠杆菌质粒中
，该质粒具有N末端6-HIS标签和MBP标签。将质粒转化为具有化学胜任的大肠杆菌LEMO21细胞（NEB） 。对于TRKA，FGFR2 ，EGFR
，IR，IGF1R ，TIE2，IL-7Rα
，TGFβ和MBP标记的微动蛋白的设计，使用补充抗生素的研究培养基自动诱导培养基进行蛋白质表达 ，并在培养物中种植了一整夜
。对于HA
，PDGFR和CD3δ设计，将大肠杆菌细胞在37°C的LB培养基中生长 ，直到在OD600时细胞密度达到0.6。然后
，将IPTG添加到500 mM的最终浓度中，并将细胞在22°C下过夜以表达 。通过以4,000g旋转旋转10分钟收集细胞 ，然后重悬于裂解缓冲液（300 mM NaCl
，30 mM Tris-HCl（pH 8.0），用DNase和蛋白酶抑制剂片剂的0.25％CHAPS ，用于细胞测定样品0.25％
。将细胞用Qsonica Sonicators Sonicator裂解4分钟（每次2分钟
，10 s On，10 s关） ，振幅为80％。通过以20,000克离心30分钟来阐明可溶性部分 。通过固定的金属亲和色谱（Qiagen）纯化可溶性部分，然后用FPLC SEC（SuperDex 75 10/300 GL
，GE Healthcare）纯化
。所有蛋白质样品均以SDS -PAGE进行表征，并且纯度大于95％。使用预测的灭绝系数在280 nm处通过280 nm的吸光度来确定蛋白质浓度 。 　　使用配备温度控制的多细胞支架的JASCO-1500仪器进行了遥远的圆柱二分性能测量。在25°C和95°C下从260 nm到190 nm的波长扫描 ，然后在快速重折（大约5分钟）后在25°C下测量
。温度融化以222 nm的速度在2°C min – 1的步骤中监测二分法信号
，平衡时间为30 s。波长扫描和温度熔体使用PBS缓冲液（20 mM Napo4，150 mM NaCl ，pH 7.4）中的0.3 mg ML – 1蛋白进行
，并用1 mM路径长度搭配进行 。通过将数据与Sigmoid曲线方程拟合来确定熔融温度
。在13个设计中，有9个保留了平均残基椭圆度值的一半以上 ，这表明TM值大于95°C。其他设计的TM值确定为拟合函数的拐点 。 　　在八位位red96（Fortebio）上收集了Biolayer干涉测量结合数据
，并使用仪器的集成软件进行处理
。对于微型培训测定，将生物素基化靶标在结合缓冲液（10 mM HEPES（pH 7.4） ，150 mM NaCl
，EDTA，3 mM EDTA ，0.05％表面活性剂P20和1％BSA中，在50 nm的50 nm（10 mM HEPES（pH 7.4）中
，将生物素化靶标加载到50 nm的链霉亲和素蛋白涂层的生物传感器上（Fortebio）。将分析物蛋白从浓缩库存中稀释到结合缓冲液中 。在仅结合缓冲液中的基线测量后，通过将生物传感器浸入含有靶蛋白的井中的生物传感器（关联步骤） ，然后将传感器浸入基线/缓冲液（分离）来监测结合动力学
。TIE2和IGF1R迷你插头的结合亲和力较低
，并且使用MBP标记的蛋白进行结合测定，以扩大结合信号。IR设计的结合测定是使用推荐方案的胺反应性第二代（AR2G Fortebio）生物传感器进行的 。简而言之 ，将小蛋白固定在AR2G尖端上
，并将IR样品用作指定浓度的分析物
。使用Fortebio数据分析软件v.9.0.0.14分析和处理数据。 　　对于交叉反应性测定，将每个靶蛋白以50 nm的浓度为325 s ，将每个靶蛋白加载到链霉亲蛋白尖端上 。将尖端浸入微型蛋白井中300 s（关联）
，然后浸入空白缓冲井中600 s（离解）。最大的原始生物层干涉仪信号结合用作结合强度的指标
。特定靶标的所有微蛋白粘合剂中的最大信号用于将数据归一化以进行热图绘图。 　　为了准备H3迷你蛋白酶（H3_MB）–HK68/H3 HA复合物进行结晶，在20 mM Tris中 ，将五倍的摩尔超过H3_MB与约2 mg ml – 1的HK68/H3 HA（pH 8.0）
，150 mm NaCl混合 。将混合物在4°C下孵育过夜，以促进复合物的形成
。然后通过凝胶过滤从未结合的HB_MB纯化饱和复合物。在20 mM Tris（pH 8.0）和150 mM NaCl中 ，含有H3_MB – HK68/H3 HA复合物的凝胶过滤馏分浓缩至约7 mg ml – 1 。使用我们在Scripps研究所的自动晶体机器人系统（Rigaku）使用坐式蒸气 - 扩散法建立了结晶屏幕
。在3-7天内，衍射质量的晶体在0.2 m硫代钠中生长
，而20％（w/v）PEG 3350作为沉淀物生长。通过添加5–15％乙二醇，闪光冷却并储存在液氮中直至数据收集到数据 ，从而将所得晶体冷冻保护 。在Stanford同步辐射光线（SSRL）束线12-1处在100 K处收集衍射数据
，并使用HKL-2000（参考文献51）进行处理
。使用PDB标识符4FNK（APO HK68/H3 HA）的HA模型使用Phaser52,53通过分子替换确定初始相。精炼是在Phenix54中进行的，与COOT55中的手动重建和调整交替进行 。电子密度图是使用苯金数据收集计算的 ，并在扩展数据表2中总结了改进统计
。最终坐标使用molprobity56验证。 　　人类TRKA受体ECD是使用杆状病毒在昆虫细胞中产生的
，并如前所述制备57 。HI5细胞与编码TRKA ECD和内糖苷酶H的杆状病毒摇动Fernbach烧瓶共同感染。在通过离心回收上清液之前，允许培养物进行65小时
。通过添加50 mM Tris（pH 8.0） ，1 mm NICL2和5 mM CaCl2沉淀出来自培养基的成分
，并将上清液在硅藻土上过滤。该滤液是批处理到Ni2+-NTA树脂的批次，在HBS（HEPES缓冲盐水：10 mM HEPES（pH 7.3） ，150 mM NaCl）中用200 mM咪唑洗脱
，并在SEC上通过SEC纯化SuperDex-75柱（Cytiva Life Sciences） 。为了制备TRKA - 微动蛋白复合物，将过量的微型蛋白与TRKA混合 ，在4°C下用1：100（w/w）羧肽酶A和B消化过夜，并由sec纯化
。 　　为了结晶
，将TRKA-配合物配合物浓缩至HBS中的38 mg ML – 1，并使用蚊子结晶机器人（SPT LabTech）以入住式格式进行筛选。最初的海胆样晶体是从0.17 m乙酸铵 ，0.085 m柠檬酸钠（pH 5.6）
，25.5％PEG 4000和15％甘油中获得的0.17 m乙酸铵，0.085 m的MCSG1筛选（Anatrace-Micrytic）获得的初始海胆样晶体 。将这些晶体粉碎 ，并以3：2：1蛋白质的比率再次将MCSG1筛选微丝微糖
，蛋白质：沉淀剂：种子量，导致单板状晶体从0.2 m硫酸铵 ，0.1 m Bis-bis-tris（pH 6.5）（pH 6.5）和25％PEG 3350和0.4 m peg peg 3350
。3350
，准备新种子，以终止播种到0.4 m硫酸铵 ，0.1 m Bis-Tris（pH 6.2）和16％PEG 3350中。 　　通过将乙二醇添加到30％（v/v）并在液氮中冷却
，从而将晶体冻结 。使用SSRL束线12-2处的X射线波长为1.033Å，在100 K处收集到1.84Å分辨率的衍射数据
。将晶体分配到具有晶胞尺寸a =42.20Å ，b =205.70Å，c =72.57Å和β= 106.42°的空间组P21。使用XDS58,59对数据进行了索引
，集成和缩放，并使用CCP4 SUITE 60,61,62的毫无意义和无目的合并 。 　　使用TRKA ECD的分离域（PDB登录2IFG）和配体的预测模型作为搜索模型 ，通过分离的域（PDB登录2IFG）在Phaser52中通过分子替换来求解结构
。最初的重建是通过Phenix.Autobuild63完成的
，然后在COOT64中进行了手动重建的迭代回合，并在Phenix65,66,67中进行了改进。使用TLSMD68选择TLS参数 ，并在整个改进中使用NCS约束69 。通过比较1.84、1.90 、1.95
、2.00和2.05Å分辨率70的配对改进的结果
，选择了数据的最终分辨率为1.84Å。最终的精制模型包括由MolproBity56计算的Ramachandran图的最喜欢区域中的97.26％的残基
。 　　SBGRID71配置和安装了本研究中使用的晶体学软件。衍射图像已将标识符839存放在SBGRID数据库中，最终模型和反射已用标识符7N3T沉积在PDB中 。 　　通过PCR扩增人FGFR4结构域3（FGFR4D3 ，氨基酸S245 – D355）的cDNA
，并将其克隆到PET-28A（+）质粒（Novagen）中
。含有N末端六边形 - 抗二烷TAG的FGFR4D3的质粒转化为BL21（DE3）细胞。将转化的细胞在37°C下在LB培养基中生长，直到OD600达到0.5 ，并以1.0 mM IPTG诱导
，在37°C下再生长4小时并收集 。通过超声处理重悬并裂解细菌细胞
。FGFR4D3使用先前报道的程序16,72,73从不溶性分数中重新折叠，并使用镍亲和色谱法（Ni2+-nta琼脂糖; QIAGEN; QIAGEN; QIAGEN）纯化至同质性 ，然后Sec（Secdex 200增加了10/300 GL，cytiva
，cytiva）与含量为200％的5％NACLES HEPER（PHR）（PHR）（25％MM NACL，MMMM MM NACL ，MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM nac）甘油。将纯化的FGFR4D3与1.2倍的FGFR2_MB混合
，并进行另一轮SEC，以隔离FGFR4D3 – FGFR2_MB复合物 。将包含与FGFR2_MB结合的FGFR4D3的分数合并并浓缩至12 mg ML – 1 ，并使用具有蚊子晶体液体处理程序（SPT Labtech）的市售结晶筛选套件进行筛选
。通过含有0.2 m氯化钠
，0.1 M MES pH 6.0和20％PEG 3,350的Proplex筛选溶液（分子尺寸）获得FGFR4D3 – FGFR2_MB复合物的晶体。在液氮中冷却之前，使用补充25％甘油的母液对晶体进行冷冻保护 。 　　使用含醇（0.02 m 1,6-己二醇 ，0.02 m 1-丁醇
，0.02 m 1,2-丙二醇，0.02 m 2-丙醇 ，0.02 m 2-丙醇
，0.02 m 1,4-丁烷二醇，0.02 m 1,3-丙糖液的焦点和0.1 m mimanter（0.02 m） ，Bufferem（0.02 m），bufferition（0.02 m 1,4）
，获得了FGFR2_MB的晶体
。（12.5％v/v MPD，12.5％PEG 1000 ，12.5％w/v PEG 3,350）在20°C下通过悬挂式蒸气 - 散发蒸气 - 散发蒸气方法
，这些方法在X射线衍射数据收集中直接在液氮中直接冷却。 　　X射线衍射数据是在晚期光子源（Argonne National Laboratory）的NE-CAT 24ID-E光束线上收集的，并使用XDS74处理 。FGFR2_MB的初始结构是使用设计模型通过分子替换为52,75获得的 ，该模型使用phenix67,75迭代完善
，然后是使用COOT64的手动构建。FGFR4D3 – FGFR2_MB复合物的结构是通过使用与FGFR1C72（PDB ID：1CVS）的域3区域的分子替换为52,75的分子替换获得的，而FGFR2_MB作为搜索模型作为搜索模型的坐标 ，然后使用aterigation coot cot45进行搜索模型
。最终结构用Molprobity75,76验证。数据收集和改进统计数据在扩展数据表2中提供 。 　　为了促进结晶
，使用TEV蛋白酶去除N端HIS-TAG，并将蛋白浓缩至30 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl中的40 mg ML – 1
。在室温下 ，使用汉普顿研究（Index-HT
，Pegrx-HT和PEG/ION-HT）的试剂盒进行稀疏的Matrix晶体筛选。使用MRC-2板中的80μl储层溶液，使用蚊子纳米结晶机器人建立由200 nL蛋白质和200 nl的每个储层溶液组成的坐姿 。有前途的棱柱形晶体从IndexHT C3条件生长 ，最佳条件范围为2.4至3.0 m丙二酸钠（pH 7.0）
。将蛋白质晶体直接冷却到液氮中。初始X射线衍射实验是在配备Micromax-007 HF旋转阳极的家用源系统上进行的，其Dectris Eiger R 4M单光子计数设备 。与Dectris pilatus3-6m检测器一起
，在高级光子源同步束23ID-D上收集了优化蛋白质晶体的X射线衍射数据
。所有X射线数据均使用XD处理。使用从头设计的模型的分子替换用于在Phenix封装中使用移相器解决晶体结构 。两个分子位于不对称单元中
。结构改进使用了无NCS约束的苯金。数据收集和改进统计数据在扩展数据表2中给出 。 　　如前所述，产生并纯化了人IL-7Rα的外生域。如上所述制备了抗IL-7Rα小型底激素
。通过将摩尔过量的纯化小型接机添加到重组IL-7Rα中来形成IL-7Rα-Minibinder复合物。通过SEC使用HBS缓冲液（pH 7.4）作为运行缓冲液 ，通过SEC纯化IL-7Rα-Minibinder络合物 。合并与IL-7Rα-Minibinder络合物相对应的分数
，并通过离心超滤浓缩，浓度为3.9 mg ML – 1
。使用BCS屏幕（分子尺寸）在293 K和坐式磁头方法中进行稀疏的矩阵结晶筛。蒸气扩散几何形状用于建立由200 nl蛋白质和100 nl的每个储层溶液组成的坐姿 ，使用蚊子纳米质体结晶机器人（TTP LabTech） 。在条件A5（0.1 M磷酸盐
，柠檬酸盐（pH 5.5）和25.0％PEG涂片培养基）的条件A5中结晶的IL-7Rα-Minibinder络合物
。晶体用添加了25％v/v PEG 400的母液保护晶体，并通过直接浸入液氮而冷却冷却。用Dectris pilatus3 x 2M检测器收集在ESRF（手榴弹）的梁线ID23-2上收集蛋白质晶体的X射线衍射数据 ，并用XDS58处理 。该结构是通过使用IL-7Rα（PDB ID：3DI2）作为搜索Model52的晶体结构在移相器中的最大样品分子替换确定的
。该复合物的三副副本位于不对称单元中。在COOT64中进行了模型（RE）构建
，并在Phenix65和AutoBuster78中进行了坐标和ADP细化 。使用COOT，PHENIX SUITE和PDB_REDO SERVER79中的模型和地图验证工具用于验证晶体学模型的质量
。最终模型和反射已与标识符7OPB沉积在PDB中。数据收集和改进统计数据在扩展数据表2中提供 。 　　R. typhi（Uniprot ID：Q68x84）的IV型分泌系统的VIRB8样蛋白质悬浮在含有20 mM HEPES pH 7.0 ，300 mm NaCl和5％甘油的缓冲液中
，悬浮在0.75 mm virb8 miniprotein粘合剂中。该络合物使用14°C的坐式蒸气 - 扩散法结晶，由0.4 ml复合物在9.9 mg ml – 1中与0.4 ml结晶剂混合（稀疏矩阵JCSG TOP96（RIGAKU试剂）条件G9：100 mm乙酸/盐酸/盐酸含量25％（ph） ，200 mM硫酸铵）在储层中与80 mL结晶的平衡
。在补充15％（v/v）乙二醇的晶体中冷冻保护晶体。在晚期光子源的LS-CAT Beamline 21-ID-F上收集了ViRB8蛋白 - 微动蛋白粘膜络合物的X射线衍射数据 。数据集成在XD中，并使用XSCALE58降低
。使用毫无意义的80评估数据质量。使用phaser52与搜索模型进行分子替代
，其中包括IV型分泌系统（PDB ID：4O3V）和Alphafold2（参考文献81）预测的VirB8 Miniprotein binder的模型 。使用COOT64和PHENIX65进行了迭代手动模型构建和精炼
。在PDB82,83沉积之前，使用Molprobity56评估结构质量（扩展数据表2）。衍射图像可在集成资源上获得可重现性 ，可在大分子晶体学84,85中获得可重复性 。 　　对于与靶标复合物中的小巧蛋白粘合剂的结构
，首先使用目标对齐整个结构
。R.M.S.D.计算了整个微型蛋白粘合剂的Cα原子。对于FGFR2微型蛋白粘合剂和IL-7Rα微型蛋白粘合剂的未结合晶体结构，R.M.S.D.叠加后在所有Cα原子上计算值 。为了分析界面核心残基的重原子 ，首先使用目标对齐结构
。只要目标上有一个残基
，其界面残基选择使用邻里水管运动员，其Cβ-Cβ距离小于8Å ，并且使用Rosetta中的分层选择核心残基选择具有默认的埋葬临界值。然后
，使用界面核心残基的重原子来计算R.M.S.D.值 。四个，八个 ，六个和六个残基分别为H3
，FGFR2，IL-7Rα和VirB8复合物结构的界面核心残基。 　　磷酸流信号传导测定法用于表征TRKA Minibinder的拮抗特性
。在信号测定之前 ，在没有NGF或其他细胞因子的基础培养基中将TF-1细胞（美国型培养物收容，CRL-2003）饥饿4小时。将细胞在96孔板中镀在带有不同浓度的TRKA粘合剂的96孔板中
，并在37°C下用人β-NGF（R＆D）刺激10分钟，然后在室温下用1.6％的多聚甲醛固定10分钟 。通过在冰冷的甲醇中重悬于冰冷的甲醇中 ，将细胞透化
，并在-20°C下储存直至流式细胞仪分析
。对于细胞内染色，将透化细胞洗涤并与Alexa Fluor-488偶联的抗ERK1/2 PT202/PY204抗体（BD）和Alexa Fluor-647结合的抗AKT PS473抗体（细胞信号技术） ，以在室内温度下为1 h。用跑步缓冲液（MILTENYI）洗涤后
，使用细胞旋转流式细胞仪（Beckman Coulter）获取每种抗体染色水平的荧光强度 。在没有TRKA粘合剂的情况下，将平均荧光强度（MFI）值减去背景 ，并标准化为最大MFI值并在Prism 9中绘制（GraphPad）
。使用Sigmoidal剂量 - 反应分析方法生成剂量反应曲线。 　　对于细胞增殖测定
，将TF-1细胞铺在96孔板中，并在含有2％FBS和不同浓度的TRKA粘合剂和NGF的RPMI-1640培养基中培养48 h 。通过使用CellTiter-GLO 2.0细胞活力测定试剂（Promega）根据制造商的协议来评估细胞增殖率
。使用Spectramax范式读取器测量发光信号 ，并使用Prism 9（GraphPad）绘制和分析数据。使用Sigmoidal剂量反应分析方法生成剂量反应曲线 。 　　对于细胞培养
，将人脐静脉内皮细胞（HUVEC； LONZA，C2519AS）在EGM2培养基中生长在35毫米涂有0.1％明胶的35毫米细胞培养皿上
。In brief, EGM2 is composed of 20% FBS, 1% penicillin–streptomycin, 1% GlutaMAX (Gibco, 35050061), 1% ECGS (endothelial cell growth factor), 1 mM sodium pyruvate, 7.5 mM HEPES, 0.08 mg ml–1 heparin and 0.01% amphotericin B in a mixture of 1×RPMI-1640 ，具有和不含葡萄糖（最终葡萄糖浓度= 5.6 mm）。通过0.2 µm滤光片过滤培养基 。在冷冻保存之前，HUVEC串行并扩展。 　　将冷冻的HUVEC解冻并在EGM2培养基中的35毫米菜肴中培养
，直到达到汇合
。之后，将EGM2培养基吸入 ，并用1×PBS将细胞冲洗两次。然后通过添加2 mL DMEM无血清培养基（1 g L – 1葡萄糖
，Gibco）恒定细胞，持续16小时 ，然后吸出饥饿培养基 。然后将细胞用FGFR2迷你底机处理
，在37°C下用EGFR Minibinder处理1小时，并在5 nm至1μm的MiniBinder之间处理
。接下来是用β-FGF（0.75 nm ，Fisher Scientific）或EGF（1 nm
，peprotech）刺激，在37°C下刺激15分钟。处理后 ，将培养基吸入
，然后用1×PBS洗涤细胞一次，然后收集总蛋白进行分析 。 　　After minibinder treatment, the cells were gently rinsed in 1× PBS before lysis with 130 µl of lysis buffer containing 20 mM Tris-HCL (pH 7.5), 150 mM NaCl, 15% glycerol, 1% Triton, 3% SDS, 25 mM β-glycerophosphate, 50 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 0.5% orthovanadate, 1%PMSF（全部从Sigma-Aldrich获得） ，苯并酶核酸酶（EMD化学物质），蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Pierce蛋白酶抑制剂迷你片
，Thermo Scientific）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒2（P5726）
。将细胞裂解物收集在新鲜的Eppendorf管中。将总共​​43.33 µL的4×Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）（含有10％β-羟基乙醇）添加到细胞裂解物中，然后在95°C加热10分钟 。煮沸的样品要么用于蛋白质印迹分析 ，要么存储在-80°C下
。 　　每孔加载总共30 µL蛋白质裂解物
，并在250 V时在4–20％SDS-PAGE凝胶上分离30分钟。然后，使用半干性涡轮转移设备（Bio-Rad）将蛋白质转移到硝基纤维素膜上12分钟 。将膜在5％BSA中阻塞1小时 ，然后将它们用在4°C的摇杆上的一抗探测过夜
。该测定法中使用的主要抗体是β-肌动蛋白（1：10,000；细胞信号技术）
，P-ERK1/2 P44/42（1：10,000；细胞信号技术）和P-AKT S473（1：2,000；细胞信号技术）。第二天，用1×TBS-T将膜洗涤3次 ，然后与抗兔HRP共轭二抗（1：10,000; Bio-Rad）孵育1小时 。对于P-AKT S473
，在洗涤后，将膜在室温下在5％的牛奶中封闭1小时 ，然后在相应的HRP偶联的二抗（1：2,000）中孵育1小时。它们是使用Immobilon Western化学发光底物（EMD Millipore）开发的
，然后使用NIH ImageJ分析软件进行定量
。蛋白质印迹结果的原始扫描显示在补充图5中。定量是通过计算每个频段的峰面积来完成的 。使用GraphPad Prism 9软件确定抑制曲线拟合和相应的IC50值
。 　　将HEK293T细胞在37°C和5％CO2的DMEM培养基中培养。与1,000 ng pCDNA3-γ共同，300 ng pMET7-HA-IL-7Rα ，200 ng pmx-ires-GFP-HJAK3，300 ng空的PMET7矢量和200 ng pgl3-b-casein-casein-casein-casein-luci stat5 stat5 pmet5 pmet5报告剂 。转染后一天
，将细胞用细胞解离缓冲液（生命技术）分离，在DMEM+10％FC中重新悬浮 ，并如前所述将96孔板中的2％的细胞播种在96孔板中
，并用50 pm的人IL-7（免疫学）（IL-7R-7R-7R-7R-7R-7Rα小型浓度）刺激过夜
。第二天使用Glomax 96微板光发光仪测量了STAT5依赖性荧光素酶活性。荧光素酶活性的倍数诱导是通过从未刺激的细胞刺激的细胞与信号的细胞的发光信号之比计算的 。将数据绘制并拟合到GraphPad Prism中的对数抑制剂与响应曲线
。PCDNA3-GAMMA COMMON是J. C. Renauld（比利时加州大学卢旺分校的医学和牙科学院）和PMX-IRES-GFP-HJAK3 VECTOR86的礼物。F. peelman（ugent，比利时）提供了PMET7-HA-IL-7Rα ，空PMET7和PGL3-β-Casein-luci载体 。 　　PEAR PROCON87用于从下一代测序（NGS）运行中组装FASTQ文件
。翻译后的组装读数与有序设计匹配
，以确定每个池中每个设计的计数数量。 　　对这里的拟合的关键假设是假设显示特定设计的酵母单元将遵循与浓度结合的标准KD方程的修改版本： 　　如果fraction_collectedi是表现出收集的设计I的酵母单元的比例，则浓度是排序的目标浓度 ，而SC50是设计的明显SC50（将收集50％的细胞的浓度） 。 　　下一个假设是所有设计在酵母表面上具有相同的表达水平
，并且100％的酵母菌细胞表达得很好，可以在“表达”门中收集（即补充图7中的正确种群）。 　　这两个假设虽然可能是错误的 ，但每个设计只能使用一个免费参数
，而无需全局免费参数
。该实验的公式（1）的正确版本可能与完美的sigmoid具有不同的形状和斜率。纠正此问题的净效应是，所有SC50值均按恒定因子缩放（这不会影响此处进行的相对比较） 。可以通过分析数据来显示不同的设计导致酵母上不同的表达水平（人们可以检查收集的分数在应饱和的浓度下对强型粘合剂进行较强的粘合剂）
。最终结果是 ，在实验上，方程（1）乘以每个设计的常数在0到1之间。这个常数似乎从0.2到0.7 。因此
，在拟合数据时，将分数收集的值高于0.2被认为是饱和的
。但是 ，由于0.2分可能代表90％的表达设计的收集和强烈表达设计的30％收集
，因此所得的SC50拟合最多可能会差5倍。替代方法是尝试估计表达水平 。但是，由于较弱的粘合剂 ，这种实验越来越困难
。 　　以下方程可用于确定单一设计的分数： 　　where fraction_collectedi is the proportion of cells carrying design i that were collected during the sort, proportion_child_pooli is the proportion of the total NGS counts for design i from the pool that was collected, proportion_parent_pooli is the proportion of the total NGS counts for design i from the pool that was the input for the sorter, and FACS collection fraction was the fraction of the yeast cells collected during the specific sort (a从FACS计算机本身提取的数字）。 　　通过确定给定排序浓度和SC50,0的预期ifaction_collectedi和SC50,0的预期ifaction_collectedi和SC50,0
，这种点估计方法最适合询问哪些设计具有SC50 <sc50,0 。应选择排序浓度和SC50,0，以使方程式（1）导致预期的fraction_collectedi小于0.2 ，以规避上述表达问题
。然后
，任何具有fraction_collectedi的设计都大于截止值，可能会说他们的SC50小于SC50,0。数量较少的设计令人怀疑 ，请参见下面的“双重转化的酵母单元 ”部分 。为了进行此分析
，消除了任何超过最大乘客电池的设计。 　　该方法可以应用于亲戚
。但是，所得的SC50将是同热实验期间的SC50。目前尚不清楚亲和力的确切数学效应是什么 ，因此我们不将Avidity SC50值与非歧视性SC50值进行比较 。 　　双重转化的酵母细胞代表了这些实验的主要误差源
。尽管很少见，但一个包含两个质粒的酵母细胞
，一种强粘合剂和一种非诱因，将通过分类过程携带非诱因质粒。最终结果是 ，非诱因最终会以跟踪强粘合剂的数量 。但是
，绝对数量大大减少
。请注意，罕见是这里的相对术语。尽管一个细胞中任何两个特定质粒的几率都很低 ，但在整个酵母池中
，双重转化的细胞似乎很常见 。 　　我们选择通过做出以下假设来解决这个问题：利用双重变化的酵母单元的非限制者从确切的一个双重转变事件中可以做到这一点
。换句话说，我们假设相同的非结合质粒并未将双重变成两种独立的结合酵母。这个假设使我们能够估计我们期望从双重转化的质粒看到的最多细胞： 　　where max_possible_passenger_cells is the highest number of cells that we would expect a non-binding plasmid to occupy, cells_collectedi_max is the number of cells collected in this round for the design with the greatest number of cells collected, cells_sorted_R1i_max is the number of cells sorted for design i_max (the same design from cells_collectedi_max), and cell copies before first sort is the number在第一个类型之前发生的每个细胞的副本（细胞分裂的2no 。）
。可以通过将收集的facs机器的数量乘以我所代表的池的比例来近似近似细胞的数量。可以通过将单元格的数量除以FACS_COLLECTION_FRACTION或将馈送到FACS机器的单元格乘以该池中设计I的比例来估算细胞_sortedi的数量 。 　　有了这个数字 ，可以为人们期望看到的单元格数设置地板。任何少于此数量的细胞的设计都不能考虑进行计算
，因为尚不清楚该细胞是否是双重转化的酵母菌细胞的一部分
。总体而言，此方法减少了假阳性粘合剂 ，但也可以去除并不能很好地转化的真实阳性粘合剂。明智的做法是简单地从下游计算中删除设计并不能很好地转换的设计 。 　　通过查看任意数量的排序实验
，可以从数据上对SC50上的上和下限进行估计
。进行P（SC50 == SC50,0 |数据）并进行贝叶斯分析，一个人到达实际SC50值的置信区间。该分析可以在各种形式上进行 ，并且产生的分布合并以产生强大的估计值 。 　　每种类型都可以建模为二项式分布，其中p = fraction_collat​​ion从等式（1）使用浓度= sorting_concentration和sc50 = sc50,0;n = cells_sortedi;x = cells_collectedi
。通过在SC50,0值的范围内执行此分析并检查二项式分布可能发生的概率
，一个人到达P（SC50 == SC50,0 |数据）。特别是对于此分析，将二项式的累积分布函数（CDF）用于零假设 ，即SC50 == SC50,0 。 　　如前所述
，应注意对P的有效范围
。明智的做法是将P到0.2的预期值限于表达水平和底层值，以使N×P不低于最大可能的乘客单元。在我们的实施中 ，如果X落入已剪辑的范围
，则返回了1个概率 。 　　进行整个分析的代码可在补充信息中获得
。 　　为了清除设计中的伪像并发现每个SSM突变的最佳方向，所有粘合剂在计算开始之前使用Rosetta beta_nov16得分函数放松（使用5个重复曲面的Fastrelax重复以最佳得分模型为单位）。然后 ，点突变体的放松使用标准的笛卡尔式法斯特拉克斯程序
，并使突变10Å之内的所有残基放松 。在目标保持恒定时，允许粘合剂上这些残基的骨架坐标放松。最好的三个（由Rosetta Energy评估）是代表模型
。补充信息中提供了XML ，以执行这种放松。 　　为了验证设计的粘合剂被折叠成正确的形状
，并使用其设计的界面与目标结合，则检查了界面 ，单体核心和单体表面的熵 。对于粘合剂上的每个位置，使用NGS中每个氨基酸的观察到的频率计算每个位置的序列熵（香农熵）
。为此分析选择的特定池是池的浓度最接近十倍
，低于父母的SC50。 　　计算每个位置序列熵后，与目标（接口核）接触的SASA隐藏位置的平均每个位置熵 ，未接触目标的SASA隐藏位置（单体核心）和未接触目标（单体表面）的完全裸露位置 。根据公式（4）进行简单的减法： 　　其中第区是该区域的平均熵
。 　　最后
，通过对实际数据进行上述计算，然后执行相同的计算100次 ，但在所有SSM点突变中观察到的计数都随机不匹配
，从而计算了分数可能来自完全随机数据的概率。这样，在100个诱饵数据集中 ，实验噪声保持恒定 。得出P值的最后一步是计算100个诱饵中间熵分数的平均值和标准偏差
，并以粘合剂​​中间熵评分的正常CDF函数找到P值
。 　　为了进一步评估设计模型的准确性，将预测的对通过Rosetta结合的影响与实验数据进行了比较。Rosetta的影响可以分为两个组成部分：单体稳定/不稳定和界面稳定/不稳定 。对单体能量的影响将影响溶液中折叠的蛋白质的分数
。然后 ，折叠蛋白的这一小部分将使亲和力恶化
，因为只有折叠蛋白才能结合。通过在天然松弛的码头和突变体松弛的码头之间估算Rosetta能量的差异来估计对单体稳定性的影响，并仅查看停靠蛋白的Rosetta评分的变化（不包括由跨界面边缘引起的能量） 。对目标能的影响计算得很相同 ，并被认为直接影响结合能。结合能是通过将停靠构象和不可抵抗的构象之间的Rosetta得分差异（但没有重新包装或最小化）来计算
。补充信息中存在XML以执行此计算。 　　通过首先确定天然蛋白的预测Δgfold来估计对P（折叠单体）的影响 。 　　其中k是玻尔兹曼常数，t是温度
，该计算设置为300 k
。 　　使用公式（5）和（6），通过执​​行所有突变的最小二乘拟合来估计天然设计的预测ΔGFOLD ，这些突变未发生在界面处的残基中。通过允许所有ΔGFOLD值在最佳最佳ΔGFOLD值的0.25 kcal mol – 1以内产生所有ΔGFOLD值来创建基本置信区间 。典型的置信区间跨越3 kcal mol – 1
。 　　手头Δgfold
，可以根据公式（7）计算对结合能的预测影响。产生最大和最小的ΔDdgrosetta的Δgfold置信范围内的ΔGFOLD值用于产生ΔDdgrosetta的置信区间 。 　　通过确定从实验数据中确定ΔDdgrosetta的置信区间是否与SC50的置信区间兼容，评估了每个位置精度
。允许一个1 kcal mol – 1的缓冲液。 　　随着手头的每个位置精度 ，Rosetta能够在单体核心和界面核心中解释的突变的总体百分比得到了评估 。这产生了整体Rosetta精度得分
。 　　以与熵分数相同的方式
，将100个带有随机洗牌的SC50值的诱饵进行了相同的步骤。确定诱饵的平均值和标准偏差，并使用正常CDF函数确定Rosetta评分的P值 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。