源自侧板中的鳍和配对鳍的起源

　　已经提出了两个替代假设来解释脊椎动物配对附属物（鳍和四肢）的进化起源。Gegenbaur3提出了后g弓的推导，而许多解剖学家随后援引了竞争对手理论 ，即侧向鳍折叠假设 。这提出了从纵向双侧鳍褶皱中得出的配对（从系统发育或地遗传学上）
，然后被细分为4,5
。尽管最近的分子研究提供了一些支持每个假设的证据2,6,7，但人们对化石记录或胚胎学的缺乏证实仍然存在重大批评1,8。某些茎脊椎动物 ，包括与Anaspid相关的化石，显示了侧向鳍褶皱的证据 。但是
，这些鳍褶皱主要由软组织组成，其中仅具有零星的骨骼元素 ，因此保存不佳。这导致了矛盾的解释9,10,11,12,13
。据推测
，配对鳍的发展计划是在中位数鳍中首先组装的，该计划在配对Fins2的起源之前出现在化石记录中。许多研究都追踪了lamp虫 ，catshark
，斑马鱼和Xenopus2,14,15中中位数鳍的细胞起源 。到目前为止，所有幼虫和成人的鳍中的所有中位数均显示出从近距性中胚层（PM）的推导 ，而已知成对的鳍片源自侧板中胚层（LPM）
。因此
，可能是从PM2转移到LPM的中值鳍计划，可能是在假设的侧面鳍褶皱形成之前。这种过渡如何或何时尚不清楚 。由于已经测定了斑马鱼中的一个中位鳍的子集 ，因此我们扩大了斑马鱼中中位鳍片的组成和起源的特征
，以确定PM衍生物是否是不变的特征
。 　　与大多数经过调查的颌脊椎动物（gnathostomes）一样，幼虫斑马鱼具有两个中位数未配对的鳍。尾鳍褶皱（或主要叶）从幼虫的尾端尾端的背部中线连续延伸 ，然后腹侧到肛门（图1A） 。前鳍折（PAFF；或小叶）沿蛋黄囊延伸的底面延伸，立即在Anus16的前面（图1A）
。中间的鳍褶皱在变形过程中被吸收
，尾鳍褶皱被三个独立的PM衍生的成年鳍14,17：尾鳍，背鳍和肛门鳍取代。没有成年的中位数鳍取代了PAFF ，这是一种发育瞬态结构16 。尾鳍褶皱的间充质可以用在TBX16L启动子对照下表达的光旋转绿色至红色荧光蛋白标记
，证实该中位数鳍是源自PM18的
。相反，我们始终未能观察到PAFF中的任何Kaede标记（图1B和扩展数据图1A）。这种标签差异并不是由于TBX16L启动子的从头活性特别是在尾部的鳍片折叠中 ，因为我们在peflization（HPF）的24小时（HPF）上方的前体中对Kaede进行了对kaede的光接收
，并将光接收的Kaede kaede kaede kaede的Kaede带到了Capodal Fin fill fold的Mesechme;同样，我们从未在PAFF中找到标记的细胞（n = 11）（扩展数据图1b – d） 。PM-LINEGE痕迹不存在PAFF标记并不是由于没有间质细胞引起的 ，因为我们观察到这些细胞在过度后3天（DPF）和增强子陷阱线ET（KRT4：GFP）SQET37（ET37）SQET37（ET37）在该细胞中
，该细胞eNCENCENCENCENCENF FIL（FIL）。ET37线进一步使我们能够可视化间充质细胞的形态，该形态显示出远端极化的星状形状 ，与所有其他鳍片的间质没有区别（图1C – E和扩展数据图1F -H）
。PAFF间充质细胞表达了鳍间充质的已知分化标志物
，包括fibulin1（FBLN1）和整联蛋白β3B（ITGB3B），并且在lyve1b：dsred2转基因线中的lyve1b retorter活性较弱 ，这也在后的final finemememememememememe1中表达了。因此，尽管具有不同的发育起源
，但Paff间充质的形态和表达谱与鳍叶的间充质的形态和表达谱相似 。 　　鳍间充质细胞的功能很少
。斑马鱼frilly Fin（FRF）突变体由于骨形态发生蛋白1a（BMP1A）的突变而显示出尾幼虫鳍褶皱的褶皱，该突变在Fin Mesectememe20中表达 ，包括在PAFF中（扩展数据图1J）。PAFF的总体形态也显示出FRF突变体中的荷叶uff（图1i
，j） 。Further, immunostaining of collagen II revealed ordered parallel collagen II fibres in all median fins of the wild type (WT), while these fibres were disorganized in both the caudal median fin folds and the PAFF of frf mutants (Fig. 1i,j), indicating that Bmp1a in PAFF mesenchyme is also required for maturation of collagen.总的来说，这些结果表明 ，PAFF的间充质细胞与尾鳍折叠折叠的功能重叠
，但具有明显的发育起源
。 　　转录因子手2在几个LPM祖细胞中表达，包括心脏 ，咽
，间皮和胸膜鳍祖细胞21,22。在检查了准确概括内源性Hand2基因表达的TGBAC（HAND2：EGFP）转基因线23时，我们观察到在2-3 DPF处幼虫胸膜中预期的绿色荧光蛋白（EGFP）表达增强（EGFP）（图2A ，b） 。尽管我们在主要未配对的幼虫鳍叶中没有观察到TGBAC（HAND2：EGFP）的表达
，但PAFF间充质的EGFP呈阳性，这表明LPM起源（图2A ，B和扩展数据图2A，B）
。此外
，在3和5 dpf处的原位杂交表明，paff间充质 ，但没有其他中间的鳍折（图2C
，d和扩展数据图2C，d）。如果LPM唯一地促进了PAFF ，那么我们可能会期望PAFF
，但没有其他中位数鳍会在LPM突变体中受到影响 。斑马鱼手2突变体移开（HANS6）在LPM衍生物中表现出缺陷，包括心脏 ，胸鳍和间皮21,22
。与LPM起源一致
，与3和5 dpf的WT相比，HANS6突变幼虫中PAFF的鳍高显着降低 ，而主要中位鳍叶的腹侧不受影响（扩展数据图3A
，B，G ，G，H
，M）。我们观察到基于HAND2反义形态固体（MO）基于敲低的结果（扩展数据图3C – F，N） 。与WT相比 ，ET37线中的Hand2敲低在3和5 dpf时严重减少了PAFF中EGFP阳性间充质细胞的数量
，而腹侧尾部中间鳍褶皱的间隙不受影响（扩展数据图3i – l，o）。手2 mo的移植；Et37突变细胞进入WT表明 ，手2的损失降低了克隆的大小
，并改变了间质细胞的形态和迁移（扩展数据图4）
。总之，这些观察结果与PAFF间充质的LPM起源一致。 　　为了确认Hand2的表达表明PAFF而不是从头表达的LPM起源 ，我们使用TG（DRL：CREERT2； HSP70L：SWITSS）转基因组合以马赛克方式永久标记LPM 24（图2E） 。在胃胃和早期生成期间
，DRL：CREERT2在LPM培养的中胚层中表达，对LPM的选择性提高 ，适用于使用4-OH-Tamoxifen（4-OHT）诱导和Loxp ecorters的谱系标记
，适用于该中胚层谱系的谱系标记
。与配对附属的LPM起源一致，我们首先记录了这种LPM谱系跟踪方法标签了配对鳍的细胞 ，尤其是幼虫胸鳍和骨盆鳍。我们在内骨椎间盘和间质的谱系标记为4.5 dpf胸鳍，以及成年骨盆鳍的内部成纤维细胞和ZnS5阳性成骨细胞（扩展数据图5A – D） 。此外
，我们在3和5 dpf下观察到PAFF间充质的LPM谱系标记，而尾鳍褶皱中的标记仅限于髓样细胞 ，这也是LPM的（图2F和扩展的数据图5E – G）
。这些数据进一步支持LPM对PAFF间充质的贡献
，但不对其他中位鳍片褶皱。接下来，我们使用dendra2绿色至红色光的荧光团的DRL驱动表达来定位PAFF间质的精确LPM起源 。在早期至中期发生（8-10--岩石阶段（SS））中 ，DRL：H2B-DENDRA2在LPM的核中表达（扩展数据图6a
，b）
。在此阶段，使用超紫色激光照明的后部LPM光转换导致该LPM领域的选择性dendra2-red标记（图2G和扩展数据图6C ，d）。然后将这些细胞追溯到40和48 hpf的迁移的PAFF间充质（n = 4）（图2H和扩展数据图6E – J
，Q – T），而未转化的对照细胞没有显示任何Dendra2-Red red Paff标记（扩展数据（图6K – PP ，U – X）
，U – U – X） 。这证实了PAFF间充质起源于LPM，在早期分割阶段 ，最多LPM的显着贡献
。 　　为了调查LPM种子的中位数PAFF是斑马鱼的磷酸质子，还是与其他脊椎动物共享的更祖先的特征
，我们检查了其他分类单元的幼虫，用于存在PAFF和使用的Hand2 Ina Hand2 Inu handu handu杂交作为lpm rpm rpm构成型细胞的效果标记。Medaka（oryzias latipes）幼虫具有明显较小的PAFF ，仅具有较少数量的间充质细胞
，如Nomarski成像所检测到（图3A，B） 。这些间充质细胞具有远端突出的细胞延伸 ，并且在鳍片中大多是近端的
，其中间质空间最厚（图3B）。因此，Medaka Hand2在PAFF中以点状模式近端表达 ，与间充质表达一致
，并且在其他中位鳍片褶皱中未表达（图3C和扩展数据图7a – C）
。为了确认这一点，我们通过注入-6.35DRL：EGFP构建体来表达早期Medaka LPM的EGFP。我们在PAFF的间质细胞中瞬时看到了表达 ，在稳定的转基因胚胎（八个PAFF间质细胞中
，在四阶段36级TG（-6.35drl：EGFP）转基因MEDAKA EMBRYOS（EGFP）（扩展数据图7D，E） 。此外 ，我们使用了1,1'-二十二烷基-3,3,3'，3'-四甲基注款苯胺高氯酸盐（DII）亲脂性染料标记
，以在第20阶段（四座阶段）在第20阶段的LPM领土上标记
。与我们对斑马鱼中Paff种子间充质的位置映射一致，后LPM在Medaka Paff中始终将DII的DII注射DII始终标记为间质（在9个标记的胚胎中 ，总共有27个细胞）（扩展的数据中的9个标记的胚胎中
，有27个细胞）。基底肌动杆菌，即美国paddlefish（多生子曲察） ，也形成了瞬态幼虫PAFF8 。我们在第36和39阶段之间鉴定了Paff间充质细胞中P. spathula Hand2的表达
，但是从尾部的FIN褶皱中显然不存在Hand2表达（图3D，E和扩展数据图7J – L）
。Paff Hand2间质表达持续直到PAFF回归 （大约45和46阶段）。从第39阶段开始 ，我们观察到了新生骨盆鳍的核心中的Hand2表达（扩展数据图7K
，L） 。我们得出的结论是，带有LPM间充质的幼虫PAFF对于actinopterygians是祖先
。为了确定在配对鳍起源之前 ，是否发生了lpm对中位鳍的贡献
，我们检查了无颌脊椎动物的幼虫，海七lamp虫（Petromyzon Marinus）。七lamp虫还具有较小的短暂幼虫PAFF25 ，其中检测到七lamp虫手的强，特异性表达
，handa，handa（图3f ，g）
，尽管有证据表明在背前鳍中handa表达昏暗 。最后，sarcopterygian Lungfish26的胚胎和两栖t（例如Xenopus laevis27 ，tropicalis xenopus tropicalis和axolotls15）都具有小的短暂性PAFF（图3H）
。荧光原位杂交表明单个手动2阳性间充质细胞在X. topicalis中侵入该鳍
，而不是阶段42阶段的主要中位鳍叶（图3H – J）。我们通过将-6.35drl：EGFP注射到X. laevis胚胎中，证实了这种LPM的贡献 。X. laevis的PAFF比X. topicalis大 ，我们观察到PAFF中广泛的瞬态EGFP标记与尾鳍折叠相比（扩展数据图7m – O）。因此
，我们显示了主要脊椎动物衬里代表的幼虫中PAFF间充质的LPM起源：环肠，肌动症和肌肉发达者
。 　　鉴于PAFF中位数的LPM起源 ，我们认为它可能在从PM衍生的中位鳍到LPM衍生的配对鳍的过渡中具有重要意义。我们测试了该LPM中间鳍是否可以复制为配对的LPM衍生的侧面鳍折 。斑马鱼幼虫突变体用于骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂Chordin会发生腹尾鳍褶皱复制
，尽管这些突变体是否在这些突变体中重复了PAFF28
。将低剂量的CHRD MO注入斑马鱼概括的各种腹化表型，其中包括具有重复或多个PAFF的个体（图4A ，B，F和扩展数据图8a
，b）。我们通过CHRD MO注入将这些PAFF表型观察到ET37转基因线中，这表明重复的PAFF的每个鳍折叠都包含间质（图4C ，D） 。使用TG（DRL：CREERT2； HSP70L：SWECT）的谱系跟踪
，注入CHRD MO的转基因组合表明，重复的PAFF的间充质细胞确实源自LPM（图4E）
。通过在TG（Hand2：EGFP）线上产生CHRD形态 ，然后通过灯页显微镜进行成像
，我们生成了三维循环构建，记录了沿山羊延伸的重复的PAFFS ，所有这些都避免了EGFP阳性细胞
，进一步证明了这些egfive the of the of the of the fin of fin of fin of fil of filsipe fil of for。图8C – J和补充视频1） 。值得注意的是ChRD MO注射后单个胚胎中多个平行的鳍褶皱产生（图4F）
。这些观察结果表明，LPM种子PAFF的分叉很容易源于调节腹侧BMP信号传导 ，例如通过减少背侧抑制剂Chordin的剂量。 　　为了确定多个PAFF的产生是否可以自发发展
，作为自然变化的一部分，我们检查了双尾金鱼菌株Ranchu ，该菌株已显示出由于Chordin Paralogue（CHDAE127X）29,30,30,30,30,31而显示出包括PAFF的分叉鳍褶皱 。幼虫兰丘的分叉的PAFF和尾鳍褶皱似乎与斑马鱼幼虫注入了低剂量的CHRD MO（图4J和扩展数据图8K，L）
。这些PAFF均由间充质细胞填充（图4K）。使用Hand2原位杂交作为LPM谱系的代理来推断Ranchu Paff间充质的起源
，我们观察到，重复的PAFF的核心均表达Hand2 ，而尾鳍褶皱没有（图4L – N和扩展数据图8m
，n） 。这表明，与斑马鱼paff一样 ，分叉的Ranchu Paffs也是LPM的。值得注意的是
，除了显示简单的PAFF复制的人外，有些人还具有三个或更多的平行PAFF（图4J和扩展数据图8N）
。因此 ，我们得出的结论是
，可以在斑马鱼幼虫中很容易生成的LPM衍生的配对褶皱在双尾金鱼中也自发产生。因此，它们代表了可行的形态创新 。值得注意的是 ，重复的LPM衍生的PAFF位于未来的胸膜和骨盆FIN域之间的腹外侧位置
，覆盖了gnathostomes 32中所提出的附肢形成的拟议能力条
。 　　在这里，我们在这里结合了几种模型和技术 ，已经确定了幼虫中间鳍和源自LPM的间充质核心，并将其作为PM衍生的中位鳍和LPM衍生的配对鳍之间的中间体。虽然显然是从环溶剂到两栖动物的保守
，但大多数现存的软骨胚胚似乎没有明显的PAFF 。我们使用微型层析成像（Microct）检查了弹性曲盘鲨鱼半囊的预匹配阶段，该阶段没有显示出明显的前鳍（扩展数据图9a-i）
。尽管这种模式似乎支持了在Chondrichthyan血统中某个地方的PAFF丧失 ，但我们不能排除PAFF在环溶剂和骨质中独立出现的可能性。有趣的是
，褶皱鲨鱼的胚胎和成年人，衣原体 ，确实在腹部中线显示分叉的三色褶皱（扩展数据图9J – M）
，以前被调用以支持FIN折叠假设33 。 　　PAFFS主要是短暂的幼虫结构，通常缺乏矿物质骨骼 ，这可能解释了化石记录中的较差文献
。尽管在大多数物种中
，真正的PAFF并不持续到成年，但它在Hagfish成年人中可以看出 ，与尾部中位鳍不同
，它不具有软骨射线34。在化石记录中，在包括haikouella和haikouichthys在内的某些茎脊椎动物化石中看到了前鳍 ，而kerreralepis的前鳍显示出发达的板35,36 。已知斑马鱼幼虫鳍中充质会持续存在并有助于成年Fins18的鳞片状裂，而LPM衍生的皮肤成纤维细胞在Axolotl肢体再生过程中形成软骨形成软骨37
。这些数据表明PAFF间充质产生骨骼结局的潜力。 　　双尾金鱼物种中的自发重复表明
，配对的LPM衍生的PAFF可能在进化过程中很容易出现 。在兰丘（Ranchu），我们经常观察到多个PAFF ，可以保留中位PAFF
，并将重复项分解为配对的鳍片。尽管没有证据表明现存的脊椎动物中存在侧向鳍褶皱，但hag鱼种的成年标本neomyxine biniplicata具有前部外侧配对褶皱 ，终止于近方前的Fin38终止
，但类似于与分析前鳍的部分重复，尽管它们与配对的Fin Fin Evolution decutity decutited 399
。在化石记录中 ，有证据表明
，矿化和非网层侧配对褶皱在Anaspids中很常见，尽管Anapsid和Gnathostome配对的Fins的同源性与配对的Fin Evolution以及侧面的FIN FOLL FOLL COLLESOSIS 1,11相关。咽 ，cowielepis和euphanerops显示前腹外侧配对色带结构或带有径向的三角形鳍
，而在贾莫伊蒂乌斯（Jamoytius），丝带缺乏矿物质结构12,40,41 。最近已经描述了由骨骼单位组成的骨骼腹外侧鳍最近描述的 ，tujiaaspis tujiaaspis
。这些成年成年配对的细长鳍通过胸鳍区域的前部限制的随后区域化，并由咽glepis和Rhyncholepis11,43提出并举例说明。 　　我们的工作通过将幼虫中位数鳍计划与lpm进行了配对的模型
，以配对鳍的演变，然后将鳍重复和随后的区域化与胸膜和骨盆鳍进行区域化 。我们为PAFF如何导致LPM衍生的配对鳍产生一个可能的模型（图5）
。PAFF可能起源于仅外胚层的小鳍褶皱（如在幼虫44中所见） ，随后LPM贡献会随后在LPM拓扑变化时演变而来
，例如持续体内，例如持久和/或外侧中胚层分裂45,46。然后 ，类似的LPM组织环境可能导致PAFF伸长率和复制后
，配对鳍区域化 。由于PAFF具有未配对和配对的鳍的特征，因此PAFF可能代表一个新型的进化模块 ，或者至少证明了有助于成对附属物出现的发育机制的组成部分
。