血红蛋白体在软骨细胞低氧适应性中的八个外聚细胞作用

　　Mice heterozygous for the α-globin null allele (Hba+/−, both of the adult haemoglobin genes, α1 and α2, and the region between them were deleted and replaced with a neomycin resistance cassette by homologous recombination) or for the β-globin null allele (Hbb+/−, a genomic fragment encompassing all of Hbb-b1 and aHBB-B2的5'部分被用同源重组插入的新霉素盒代替）
，由HBATM1PAZ HBBTM1TOW TG（HBA – HBBS）的小鼠（HBA – HBBS）41PAZ/J（no
。：003342，Jackson Labs）49 with wt c57bl/6J MICE产生。HBATM1PAZ HBBTM1TOW TG（HBA – HBBS）41PAZ/J小鼠称为镰状细胞小鼠（伯克利模型） ，这些小鼠均对α-珠蛋白和β-珠蛋白无效均纯合
，并携带人镰状转换（HBA0/0 HBBBBBBBB0/0HBCCR）（HU） 。HBA敲除或HBB敲除突变的纯合子因严重的贫血而死亡
。NM-CKO-200163）来自上海模型中心，以软骨细胞中的HIF1A和/或HIF2A基因敲除HIF1AF/F和/或HIF2AF/F的基因。HIF2AF/f/f/col2a1-creert2或hif1af/f/f/f/f/f/f/f/col2a1-creert2小鼠将删除hif1a和/或hif2af/f基因的第二个外显子 ，在表达这两个男性的小鼠中 。 　　为了研究血红蛋白在体内的作用
，我们通过同源重组产生了带有C57BL/6J背景的条件HBB串联小鼠
。靶向矢量旨在替代HBB-BB和HBB-BT的1-3个外显子（HBBF/+或HBBF/F;补充图8a）。筛选了胚胎干细胞的候选者，并通过PCR进一步确认 。通过PCR验证F1小鼠
。以下引物用于HBBF/F小鼠的基因分型：P1 ，5'-TGCATCTGCAGATCCCAAAAA-3'和P2
，5'-GGAGGAGGAGGAGTGTACAAGGAGGAGTTCAATAAA-3'。使用两个引物，可以扩增特定的WT（574 bp）和突变体（766 bp）DNA片段（补充图8B ，C） 。为了有条件地删除间充质细胞或软骨细胞中的HBB
，将HBBF/F小鼠育成PRX1-CRE或COL2A1-CREERT2小鼠
。 　　为了研究KLF1在软骨细胞中的作用，我们通过同源重组产生了具有C57BL/6J背景的条件KLF1-串联小鼠。靶向载体的设计以取代KLF1的第二个外显子（补充图3A） 。筛选了胚胎干细胞的候选者 ，并通过PCR进一步确认。通过PCR验证F1小鼠
。以下引物用于KLF1F/F小鼠的基因分型：P1，5'-AgggGTCTGAGAGATCAAGGTGA-3'和P2
，5'-CGGTTCCCCTAACCCCTTTC-3'。使用两个引物，可以扩增特定的WT（317 bp）和突变体（383 bp）DNA片段（补充图3B ，C） 。为了有条件地删除软骨细胞中的KLF1
，将KLF1F/F小鼠育成COL2A1-CREERT2小鼠
。 　　所有克隆都在第四届军事医科大学的无病原体状况中维持。动物研究得到了第四届军事医科大学机构动物护理和使用委员会的批准 。 　　从新生儿或胚胎小鼠的生长板中收集并用胶原酶II型消化的软骨
。接下来，从那些消化的生长板中提取基因组DNA。通过基因组DNA的qPCR对HBA ，HBB
，HIF1A，HIF2A或KLF1的有效重组量化 ，具有相应的引物 。 　　将小鼠安乐死在指定的年龄
，并在室温下收集软骨组织并将其固定在4％多聚甲醛中
。将产后骨骼组织在0.5 m EDTA中脱钙10天，然后嵌入石蜡中。根据标准方案 ，在4μm厚度下以4μm的厚度取序切片
，并用降血石和曙红（H＆E）染色 。根据制造商的指示，使用套件（BA-4079A ，BASO）进行Masson三色染色
。使用随附的软件使用数码相机（DP71，Olympus）捕获所有图像
，并使用显微镜（BX51，Olympus）可视化图像。 　　使用辣根过氧化物酶（HRP）耦合的山羊抗兔二级抗体（1：500; AB7090 ，ABCAM
，ABCAM）和二氨基苯胺用二氨基苯胺一起用作底物 。通过对HBA（MA5-32328，Invitrogen）或HBB（PA5-60287 ，Invitrogen）抗体的免疫组织化学检测HBA或HBB的表达。在0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中将石蜡切片脱水
，再水化并洗涤
。内源性过氧化物酶活性通过将切片浸入0.3％H2O2中30分钟来阻断。通过在阻塞缓冲液（5％BSA，20％的正常山羊血清和0.1％Triton X-100中的TBS）中孵育截面 ，从而阻止了非特异性结合 。随后
，将切片与对HBA或HBB的一抗孵育，并在4°C的混合室中阻塞缓冲液中稀释1:50
。然后将它们在PBS中洗涤 ，并在以1：100稀释下与HRP结合的继发抗兔抗体的混合物中孵育。二氨基苯胺底物用于检测
，并将血久毒素用于抗染色 。然后将样品脱水并安装以进行可视化
。具有棕色核的细胞被视为阳性染色。具有抗HIF1α（兔多克隆； PA5-60287，Invitrogen） ，HBA（MA5-32328，Invitrogen）或HBB（PA5-60287
，Invitrogen）抗体的免疫荧光度抗体根据标准的分配协议进行 。 　　肱骨的软骨生长板的近端或股骨的软骨生长板的末端是由pentobarbitone量过量杀死的胚胎或新生儿小鼠的近端，从E14.5到P7的年龄不等 ，剖析了关节囊
。人膝关节软骨来自急性创伤患者。将软骨生长板或关节软骨用0.1 M PBS洗涤3次
，并在2.5％的戊二醛中用4％多聚甲醛固定24小时 。通过电子显微镜成像的样品在上升的70％，80％ ，90％和100％（每个变化15分钟）中脱水
。干燥后
，将样品用液氮冷却，骨折并在密封盘中放置4天 ，以在室温（24–26°C）下进一步脱水。使用高分辨率的溅射夹（Shinkku VD MSP 1s）将样品与铂覆盖 。使用扫描电子显微镜（S-4800
，Hitachi）成像电子显微镜样品。 　　为了排除软骨组织外周血交叉污染的可能性，切成切片（4μm）切成切片的P6小鼠的石蜡包裹的软骨生长板
。将切片在二甲苯（30分钟）中脱瓦 ，然后在100％（持续10分钟）乙醇中脱氧。将切片在真空冻干机中干燥12小时 。一旦干燥
，通过玻璃切割机切割了载玻片上包含软骨组织的区域（1 cm2），并通过扫描电子显微镜（S-4800 ，Hitachi）观察到
。 　　为了观察软骨细胞内的恋爱细节，按照标准程序进行了骨phy骨生长板的透射电子显微镜（TEM）。E14.5
，E18.5或P3小鼠的eily骨生长板通过用剪刀和手术刀去除关节胶囊，韧带和形而上学的骨 ，快速地收集了手术 。将软骨组织固定在4％多聚甲醛中
，在2.5％的戊二醛（pH 7.3）中固定24小时
。将组织段从70％到100％的乙醇中脱水，并浸润并嵌入SPI-PON812树脂（SPI-CHEM）。然后将它们以5 µm的厚度切片 ，并用1％甲苯蓝色染色
，以进行光显微镜评估 。将来自选定区域的组织样品切成超小感组（EM UC6，Leica）的切片 ，并用JEM-1230电子显微镜进行研究
。修剪了用于超微结构评估的块
，在60 nm处进行了修剪，用柠檬酸铅和乙酸铀酰染色 ，并使用透射电子显微镜（JEOL）检查。电子显微照片由Gatan数码相机（832 SC1000
，GATAN）及其应用程序软件（Gatan Digital Micrograph 3.0软件）捕获 。 　　为了观察用HBB -EGFP转染的HEPG2和PLC/PR/F5细胞内的恋犬细节，按照标准程序进行了TEM
。将约1×107的细胞铺在带有I型胶原蛋白的六孔板中。转染后24小时将细胞固定 ，并用磷酸盐缓冲液（0.1 m，pH 7.4）在4°C下固定在2.5％（v/v）的戊二醛中12小时
，然后在4°C的磷酸盐缓冲液中固定1％（w/v）osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium osmium 。之后，通过分级乙醇系列（30％ ，50％
，70％，80％ ，90％
，100％和100％，4°C下的5分钟）脱水 ，直到纯丙酮（2×5分钟）。在分级混合物（3：1、1：1和1：3）中浸润样品
，丙酮和SPI-PON812树脂（16.2 mL SPI-PON812，10 ml DDSA和8.9 mL NMA） ，然后更改为纯树脂
。最后
，将细胞与1.5％BDMA嵌入纯树脂中，并在45°C下聚合12小时 ，然后在60°C下48小时。将超薄切片（70 nm）用微型组（EMUC7，Leica）切片
，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并通过透射电子显微镜（Fei tecnai Spirit 120 kV）进行检查 。 　　为了确定软骨细胞内的仇恨是否含有HBA和HBB ，通过免疫质量银染色方法进行了免疫电子显微镜以检测HBA和HBB
。将P3小鼠的周期生长板切成小块
，直径约为0.5 mm，并固定在4％多聚甲醛和2.5％的戊二醛（pH 7.3）中24小时。用0.1 M PB彻底洗涤小块的软骨组织 。与阻塞缓冲液（5％BSA ，20％正常山羊血清和0.1％Triton X-100）在TBS中孵育1小时后
，以阻止非特异性结合，将小块的软骨组织与原代抗体HBA孵育HBA（1：100; MA5-32328 ，Invitrogen）或HBB（1：100; PA5; PA5; PA5; PA57; pA55; pA55;1:50在4°C的加湿室中阻止缓冲液过夜
。然后将它们在PBS中洗涤
，并在二级抗体的混合物中孵育过夜，抗兔IgG以1：100稀释度和1：200稀释度以1：100稀释和生物素化的抗Guinea Pig IgG结合至1.4 nm金球（纳米蛋白酶）。冲洗后 ，将切片在PBS中的2％戊二醛中固定45分钟 。用HQ银试剂盒（纳米探针）在黑暗中进行银色增强
，以可视化HBA或HBB免疫反应性
。在增强台阶之前和之后，将切片用去离子水冲洗几次。然后将它们在ABC溶液（Sigma）中孵育4 h ，并通过葡萄糖氧化酶-3 、3'-二氨基苯胺法进行可视化 。在0.1 M磷酸盐缓冲液中，将免疫标记的软骨组织用0.5％四氧化物固定1小时
，在分级乙醇串联中脱水，然后在氧化丙烷中脱水 ，最后在SPI-PON812中固定在SPI-PON812中（SPI-chem）
。聚合后
，将软骨组织修剪在立体显微镜下，并安装在空白的树脂存根上。用超大核病（EM UC6 ，Leica）切割超薄切片
，并安装在网格上（每个网格6-8个切片） 。然后将它们用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色， 并在电子显微镜（JEM-1230 ，JEOL）下观察到。电子显微照片由Gatan数码相机（832 SC1000
，GATAN）及其应用程序软件（Gatan Digital Micrograph 3.0软件）捕获
。 　　为了检查HBA或HBB在体外软骨细胞中的作用，进行了软骨组织的培养。分离了E14.5或E18.5的整个肱骨或股骨 ，分离出具有WT
，HBA +/-，HBB +/- ，HBA - / - 或HBB - / - 的基因型 。将小鼠编号并基于基因型进行分组
。对于每只小鼠，肱骨或股骨用于体外培养。将肱骨或股骨用0.25％胰蛋白酶在37°C的六孔板中消化15分钟 。将样品反复移动
，直到去除软骨生长板上的肌肉和肌腱
。然后，通过尖锐的镊子轻轻收集软骨生长板 ，并用补充10％FCS的α-MEM培养基培养
，每ML青霉素100单位，50μgml-1链霉素（Gibco）在12件板中。对于缺氧实验 ，在补充10％FCS的α-MEM中
，在1％O2下生长软骨组织3-6天 。缺氧实验后，收集了这些培养的​​软骨并准备进行组织学和TUNEL检查
。 　　对于软骨细胞的原发性培养 ，将P3小鼠的生长板通过剪刀剪切成小皮尔斯
，并用溶解在37°C的α-MEM培养基中的0.1％胶原酶II型（GIBCO）消化12小时。然后，将样品反复移动到单个细胞中 。将细胞通过75μm尼龙网格过滤 ，并在六孔板中培养
，并用补充10％FCS的α-MEM培养基进行过滤
。将原发软骨细胞以每CM2的6×105细胞的密度为单位。媒介每隔一天更改 。对于缺氧实验，在补充10％FCS的α-MEM中 ，原发性软骨细胞在1％O2下生长48-72 h。 　　按照先前所述的53进行TUNEL分析，并根据制造商的指示使用原位凋亡检测试剂盒（11684795910
，Roche）进行
。 　　为了检查小鼠生长板中软骨细胞氧合的状态EF5（一种低氧药物）。EF5是2-硝基咪唑，依anidazole的五氟衍生物 ，通过抑制氧气可抑制的硝酸还原酶的代谢减少 。对小鼠生长板的固定切片进行了EF5染色
。E19.5 HBB杂合怀孕的女性在体重的1％（v/w）时注入10 mM EF5（Merck）。两到三个小时后
，将小鼠在冷PBS中解剖 。通过切割关节胶囊，韧带和形而上学的骨 ，用剪刀在4°C下固定在冷丙酮中10分钟
，然后将空气干燥并用PBS冲洗，从而在外科手术中迅速分离出外科生长板
。在室温下用PBS中的5％小鼠血清进行阻塞30分钟。将切片用小鼠抗FEF5 Cy3偶联抗体（EF5-30C3 ，Merck）染色
，在3％BSA和PBS中以1:20稀释，在37°C下1 h 。用PBS将载玻片冲洗5分钟 ，并用水位安装介质安装
。使用适用于DAPI和CY3以及数码相机的过滤器的荧光显微镜记录EF5和DNA荧光。 　　通过迅速将关节胶囊
，韧带和形而上学的骨用剪刀来收集从P1到P7小鼠的软骨生长板 。在0.1 m的冷PBS中将生长板洗涤3次
。然后，将软骨组织剪切 ，研磨并裂解成含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的无线电免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液。通过12％SDS -PAGE凝胶分离软骨组织或软骨细胞裂解物（50μg），并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上 。在室温下
，在Tris缓冲盐水中用5％（w/v）的脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中用5％（w/v）的脱脂牛奶阻塞PVDF膜在室温下以5％（w/v）的含量阻塞。然后，用抗HBA（1：1,000; MA5-32328 ，Invitrogen）或HBB（1：1,000; PA5-60287
，Invitrogen），Invitrogen）和α-微管蛋白（1：3,000; 2125; 2125 ，2125
，细胞信号技术）抗体抗体探测膜
。使用抗兔（1：10,000; A0545，Millipore）或抗小鼠（1：10,000; M4155 ，Millipore）抗体在室温下1小时进行次要检测。在用PBS广泛洗涤后
，通过增强化学发光和暴露于X射线膜来检测到感兴趣的蛋白质信号 。 　　在RIPA缓冲液中提取来自原发软骨细胞或ATDC5软骨细胞的蛋白质
。每个样品的50μg蛋白样品均在4–20％TRIS凝胶的预铸件中电泳。凝胶使用Bio-RAD标准系统转移到PVDF膜上后，在室温下以5％非脂肪牛奶/1×TBST在5％的非脂肪牛奶/1×TBST中阻塞 ，并在4°C下与以下主要抗体孵育过夜：HIF1α（HIF1α（HIF1-1：20960-1-ap
，proteintech，proteNintech）在1：1：1,000）（也称为ePAS）（也是epas的22）（nif 2）（NIF 2）（NB）（NB）（NB）（NB）（NB）（nb）（n）（nb）1 nif 2（nb）（nb） 。1：1,000 ，KLF1（也称为EKLF）（PAB5859，ABNOVA）在1：1,000
，AMPK（A1229，Abclonal）1：1000 ，PAMPK（AP1002
，ABCLONAL），1：1,000 ，caspase 3（caspase 3（caspase 3）（caspase 3）（A19654
，Abclonal），Abclonal at 1：1,000 ，000
，000，000 ，000
，000，ablonal at a abclon ablonal a abclon ablonal at a abclon ablonal at a abclon ablonal abclon abclon abclon ablonal在1：1,000和KDM5B（A15740 ，Abclonal）为1：1,000
。然后将膜与HRP偶联的抗兔（1：10,000; Millipore）或抗小鼠（Millipore）抗体在室温下1小时在1×TBST中孵育。通过使用增强的化学发光检测信号 。使用蛋白质标记物（PM2610，Smobio）确定蛋白质分子量
。通过Bio-Rad图像实验室系统获取和分析蛋白质印迹图像。使用ImageJ进行定量 。α-微管蛋白信号用于蛋白质量归一化
。 　　用低温恒温器（Leica Biosystems）将P3小鼠的冷冻肱骨纵向软骨切成切片（10μM）。将切片放在笔膜框架载玻片（Leica微型系统）上
，并将其固定在95％乙醇中1分钟 。将载玻片浸入蒸馏水中1分钟三次，以清除OTC试剂。然后 ，如前所述
，通过H＆E染色对切片进行染色：Harris haematoxens（BA-4041，BASO） ，30 s；去离子水
，3分钟；曙红（BA-4042，BASO） ，5 s;95％乙醇
，15 s；和100％乙醇，15 s
。将切片在室温下（24–26°C）在真空冻干中干燥24小时。干燥后 ，根据制造商的说明
，将软骨细胞与LMD6000（Leica Microsystems）一一进行了微分解 。将大约200个软骨细胞解剖的样品聚合到0.5 ml微输出管的盖中，并溶解在组织提取缓冲液（Picopure RNA分离试剂盒 ，应用的生物系统）中以进行质谱法（仪器：Orgement：Orbitrap ascend tribrid MS）
。 　　通过质谱法测定了新生小鼠生长板的软骨细胞的蛋白质。裂解缓冲液由PBS缓冲液（pH 7.2）制成，并添加了2％SDS
，10％甘油，10 mM Dithiothreitol（DTT） ，1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物（Roche Applied Science） 。根据具有已知浓度的标准蛋白标记物
，在Coomassie蓝色染色的SDS凝胶上估计样品中的总蛋白质
。为了进行质谱分析，将每个样品中的蛋白质分离在12％SDS凝胶（1.0 mm厚）上 ，并用Coomassie Blue G-250染色。将整个车道切成15片
，然后切成凝胶胰蛋白酶消化 。根据Wisniewski等人54所述的FASP程序进行蛋白质消化
。简而言之，将蛋白质片段在90°C下在30μLSDT缓冲液（4％SDS ，100 mM DTT和150 mM Tris-HCl pH 8.0）中溶解了5分钟。使用200μLUA缓冲液（8 m尿素和150 mM Tris-HCl pH 8.0）除去洗涤剂
，DTT和其他低分子量组件，以重复的超滤（Microcon单元 ，30 kDa）去除 。然后
，在UA缓冲液中添加100μL0.05 m的碘乙酰胺以阻断减少的半胱氨酸残基，并将样品在黑暗中孵育20分钟
。用100μLUA缓冲液洗涤过滤器三次 ，然后两次100μL25 mm NH4HCO3洗涤。最后，将蛋白质悬浮液用40μl25mm NH4HCO3在37°C的40μl25 mM NH4HCO中消化
，并在37°C下过夜，并将所得的肽作为滤液收集 。 　　液相色谱 - 倾向质谱法（LC – MS/MS）测量在与Q精确质谱仪（Thermo Fisher Scientific）耦合的易于纳米LC（Thermo Fisher Scientific）上进行。使用100分钟的水 - 乙腈梯度 ，将肽分离在反相（15 cm
，内径15厘米，内径75-μm）上
。所有MS测量均在正离子模式下进行。每个扫描周期由一个完整的扫描质量谱（M/z 300–1,800）组成 ，然后是最激烈的离子的20 ms/ms事件
，具有以下动态排除设置：重复计数2，重复持续时间30 s和排除持续时间90 s 。首先将样品加载到陷阱柱上 ，以10μlmin -1的流速为10μl
，然后在多维液相色谱（MDLC）中以1,200 nl min -1的流速洗脱，通过将线性梯度施加为0-50％b 60 min
。Q精确质谱仪用于MS/MS实验 ，离子转移毛细管为160°C
，并具有3 kV的静电电压。归一化碰撞能量为35 。 　　所有数据文件均使用Bioworks浏览器Rev创建
。3.1（Thermo Electron）具有前体质量耐受性为1.4 Da，阈值100 ，最小离子计数为10。使用sequest搜索引擎（ProteOme Discoverer Software 2.3.0.0.523），搜索了获得的MS/MS光谱 。目标数据库包含glycine_max蛋白序列（80,292个条目）于2010年5月20日从NCBI数据库下载
。搜索是在软件中的胰蛋白酶酶参数中进行的。蛋氨酸氧化仅被指定为差异修饰
，胱氨酸甲甲基甲基是固定的 。所有输出结果均使用名为“ build Summary
”的内部软件组合
。将过滤器设置为错误发现率≤0.01。 　　从新生对照和HBB-CKO突变小鼠中分离出的膝盖软骨，用液氮迅速冷冻 。24小时后取出样品 ，并加入100μl水/50 mg
，以通过组织均质剂研磨。之后，将组织匀浆摇动30 s ，并用400 µl甲醇乙腈溶液（1：1
，v/v）添加，然后进行第二次冲击60 s
。在4°C下进行超声处理两次后 ，将样品在-20°C下放置1小时
，并在4°C下离心20分钟（14,000 rcf），然后收集上清液以冷冻干燥。通过LC -MS在液相色谱系统（1290 Infinity ，Agilent）和AB Sciex API 5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX）上分析提取物 。高性能LC的详细信息如下：将样品放在4°C的自动采样器中
，柱温度为45°C，流速为300 µL min-1 ，注射体积为2 µl
。5500 QTRAP ESI源条件如下：源温度为450°C，离子源气体1（GAS1）：45
，离子源气体2（GAS2）：45，窗帘气体（CUR）：30 ，离子帕克电压浮动（ISVF）：4,500 V. v。能量代谢的标准物质用于纠正保留时间并识别代谢物 。 　　进行了Alcian Blue和Alizarin S红色对骨骼制剂的全面染色
。简而言之
，胚胎被剥皮并肠胃。在95％乙醇中固定4天后，将胚胎在Alcian Blue溶液中染色过夜 。用70％乙醇洗涤后 ，艾丽莎白的红色溶液染色过夜
，并转移到1％KOH中1周
。最后，将胚胎转移到1％KOH/20％甘油中2天 ，并储存在50％乙醇/50％甘油中。使用配备了数码相机（DP71
，Olympus）的立体显微镜（SZX16，Olympus）拍摄骨骼的图像 。 　　根据制造商的标准方案 ，收集了来自小鼠的软骨组织或原发性培养的软骨细胞
，并在Trizol（Invitrogen）中裂解进行RNA分离
。从1μgRNA最大值第一链cDNA合成试剂盒（Takara）合成cDNA。实时PCR是在ABI Fast7500上使用Maxima Sybr Green QPCR Master（Takara）进行的 。先前已经描述了底漆对25,55,56,57,58，并包括在补充表3中。荧光qPCR是通过实时荧光QPCR仪器（qtower3g ，jena Bioscience）及其应用软件（QPCRSOFT 3.4）进行的
。通过Microsoft Excel（2306 Build 16.0.16529.20164）分析了实时PCR结果。 　　收集P6小鼠膝关节的软骨组织进行RNA-Seq分析 。使用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检查提取和纯化的RNA的完整性
。使用Truseq RNA样品制备试剂盒（Illumina）生成库。使用Illumina Hiseq 2500 Suequencer对库进行测序 。上海生物技术公司执行了上述所有过程
。 　　小鼠软骨用于CHIP – QPCR实验。将P3小鼠的生长板通过剪刀剪切成小刺，并用溶解在37°C下溶解在α-MEM培养基中的0.1％胶原酶II型（Gibco）1小时 。然后
，将样品反复移动到单个细胞中
。先前已经描述了芯片实验程序的细节59。The following antibodies were used for ChIP–qPCR: KLF1 (1:50; 61233, Active motif), H3K4me3 (1:50; A2375, ABclonal), H3 (1:50; 17168-1-AP, Proteintech) and nonspecific IgG (rabbit, 1:50; 30000-0-AP, Proteintech).引物对先前已描述为60,61，并包括在补充表3中 。 　　在Xijing医院病理学部收集了来自急性创伤患者的人类健康关节软骨标本 ，并在知情同意书中
，并由第四个军事医科大学Xijing医院研究伦理委员会批准该项目
。在室温下将软骨标本固定在4％多聚甲醛中48小时，并在0.5 m EDTA中脱钙30-90天 ，然后嵌入石蜡中。串行切片以4μm的厚度取
，并用H＆E或Masson Trichrome染色染色 。 　　将293T，HEPG2和HCT116细胞维持在DMEM（MacGene Tech）中 ，并补充了10％FBS（Kang Yuan Biol）和1％青霉素 - 链霉素（MacGene Tech）。在补充了10％FBS（Kang Yuan Biol）和1％青霉素 - 链霉素（MacGene Tech）的RPMI-1640（MacGene Tech）中培养PLC/PR/F5细胞
。在补充10％马血清（Kang Yuan Biol）
，5％FBS（Kang Yuan Biol）和1％青霉素 - 链霉素（MacGene Tech）的RPMI-1640（MacGene Tech）中培养PC12细胞。所有细胞在37°C下与5％CO2孵育 。 　　在本研究中构建了表达HBB和HBA蛋白的质粒
。HBB和HBA cDNA在北京基因组学研究所（中国北京）合成。WT HBB和HBA及其突变体通过无缝的同源重组克隆到PQCXIP – EGFP或PQCXIP -MCHERRY中 。PBABE -CAAX – MCHERRY在实验室中维持
。施工细节显示为补充表4。 　　对于质粒转染，将约3×105的细胞在12孔板中铺板 ，以I型胶原蛋白（354236
，BD Bioscience）预先涂层，并培养12小时 。然后根据提供的方案 ，用Lipofectamine 2000试剂（11668019，Thermo Fisher Scientific）用各自的构建体转染细胞
。 　　转染后24小时
，在玻璃底板（巢生物技术）的细胞上进行广场成像，如前所述62。使用了机动阶段和NEO真空冷却科学CMOS摄像头（Andor Technology）的尼康TI-E显微镜 。使用×10或×20 Apo物镜收集图像 ，并暴露于15毫秒的差分干扰对比度通道和FITC通道的150毫米暴露
。表达绿色荧光的细胞数量被计为分母
，并且将焦点阳性细胞的数量计算为分子。 　　在15毫米的玻璃底盘（Nest）上生长细胞，并使用×60油目标使用Ultraview Vox共聚焦系统（Volocity 6.3.00 ，Perkin Elmer）系统拍摄图像 。为了进行两个HBB – EGFP焦点的融合实验
，转染后24小时，每5分钟成像一次细胞。 　　使用尼康共聚焦显微镜系统的FRAP模块进行光漂白（FRAP）测定后的荧光恢复（FRAP）
。使用488 nm激光束将HBB – EGFP漂白。使用100％激光功率收集了漂白量集中在感兴趣的圆形区域上 ，并收集了及时的图像 。使用尼康共聚焦显微镜系统（NIS Elements AR 4.50.00）测量荧光强度
。值报告为相对于降落前的时间点的比率。GraphPad Prism用于绘制和分析FRAP结果 。 　　血液是通过返回的轨道穿刺收集到血液收集管（BD空泡）中
，在400g下离心15分钟以去除上清液，然后获得WT和HBB-CKO软骨细胞 ，并如上所述
。将含有3 mg血红蛋白和1×107软骨细胞稀释的RBC与20μLBSA（Thermo Fisher Scientific）和20μL的抗泡沫剂（Sigma Aldrich）混合在4毫升血液氧化缓冲液中。使用氧合分解分析仪（Bloodox-2018分析仪
，SOFTRON生物技术）来确定氧解离曲线 。将样品缓冲液吸入比色杯，平衡并带到37°C ，并同时用空气氧气为100％
。调整PO2（氧局部压）值后，样品用氮将样品脱氧。使用Clark氧电极来检测X –Y记录器X轴上X轴上氧张力的变化
，而Deoxyhaemoglobin级分通过双波长分光光度计在560 Nm和570 nm和570 nm处同时监测，并在Y轴上显示 。最后 ，将氧解离曲线（ODC）自动记录在图形纸上
，并将P50值推在X轴上，因为O2饱和度为50％
。 　　血液氧化缓冲液包括130毫米NaCl（中药组化学剂） ，30 mM TES（Sigma Aldrich）和5 mM KCl（中药组化学剂）
，pH 7.4±0.01。 　　将约2×107 293T细胞的细胞铺在150毫米的盘中，该培养皿中有I型胶原蛋白（354236 ，BD Bioscience）
，并培养12小时 。PQCXIP – HBA1-MCHERRY和PQCXIP – HBB-EGFP共转染为293T细胞，比为1：8。转染后48小时去除培养基 ，然后在4°C下用10 mL DDH2O爆裂细胞20分钟
。然后
，将样品以3,000克离心15分钟，以去除上清液 ，并用4毫升的PBS用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（CW2200S，CWBIO）重悬于。如上所述获得了RBC 。 　　为了探索Hedy在低氧条件下是否可以充当氧气来源
，开发了嵌套的共培养测定法
。简而言之，将低氧敏感的PC12细胞镀为15毫米盘中的低氧报告细胞（Nest） ，该细胞用I型胶原蛋白（354236
，BD Bioscience）预涂，该细胞固定在35毫米（嵌套）内部的丙酮中。将4毫升或5×107 RBC的血红蛋白冷凝物添加到35毫米菜肴中 。然后将35毫米的盘子用塑料膜和parafilm（Bemis）密封24小时
。随后 ，通过用两对引物：β-肌动蛋白-F：gatcaagatcattgctcctcctcctga提取PC12细胞中的总RNA进行定量分析；β-Actin-R：cagctcagtaacagtccgcc;HIF1α-F：CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA；HIF1α-R：GCTGTCCACATCAAAGCGTACTCA。 　　每只出生于5天（P5）的小鼠的外周血（20 µL）用于常规测试 。通过恢复轨道穿刺到肝素化玻璃毛细管中收集全血
。RBC计数和血红蛋白浓度由自动血液分析仪（XP-100
，SYSMEX Corporation）及其应用程序软件（XT2000I1800I IPU）进行。 　　根据制造商的说明，使用原发软骨细胞用ROS分析试剂盒（Cayman Chemicals）来量化总活性氧（ROS）积累 。在37°C下用胰蛋白酶-EDTA（0.05％）进行短暂胰蛋白酶消化后 ，将细胞在黑暗中与5 mM二羟化乙胺探针在37°C下孵育30分钟
。此后
，将细胞用ROS染色缓冲液洗涤两次。用流式细胞仪（Coulter-XL）进行流式细胞仪 。EXPO32 ADC软件用于分析。 　　根据制造商的说明，使用Mitosoxassay试剂盒（Invitrogen）进行了线粒体ROS的积累
。简而言之 ，在黑暗中
，在37°C的37°C下，将孤立和培养的原发软骨细胞与5 mM Mitosox探针一起孵育20分钟。在37°C下用胰蛋白酶-EDTA（0.05％）进行短暂胰蛋白酶消化后 ，用FACS缓冲液（1×DPB+5％FBS）洗涤细胞两次，并使用流式细胞仪（Coulter-XL）进行流式细胞仪 。EXPO32 ADC软件用于分析
。 　　他莫昔芬处理3天后
，收集了P5 HBBF/F（对照）或HBBF/F/COL2A1- CREERT2（HBB-CKO）的生长板的软骨，并立即通过液氮淬灭。液体氮蒸发后 ，软骨存储在-80°C下 。如上所述
，通过LC -MS分析样品
。 　　在体外培养从P5 HBBF/F（对照）或HBB-CKO小鼠中分离出的原发软骨细胞。在用胰蛋白酶-EDTA（0.05％）并用锥虫蓝色染色的短暂胰蛋白酶消化后，计算了活细胞和死细胞的数量 。 　　为了进一步探索细胞中的仇恨者在低氧条件下是否可以充当氧气的来源 ，在狭窄间隔中
，血红蛋白和细胞培养的细胞内表达得到了发展
。简而言之，将1×105 ATDC5细胞（ECACC）铺在35毫米（NEST）中 ，并培养12小时。质粒PQCXIP – HBA1-MCHERRY和PQCXIP – HBB – EGFP共转染到293T细胞中
，通过Lipofectamine 2000 Reagent（11668019，Thermo Fisher Scientific） ，Lipofectamine 2000试剂的比例为1：8（总计900 ng） 。转染后二十四小时
，将生长培养基替换为在1％O2中预处理4 h的新鲜培养基4小时
。之后，用塑料膜和parafilm（Bemis）密封菜肴2小时。然后 ，用4％多聚甲醛固定细胞，并用抗体HIF1α（1：500
，36169，CST）染色 。将次级抗体施用1小时 ，然后用PBS洗涤3个10分钟
，然后用DAPI（Invitrogen）安装抗抗剂试剂。为了检测HIF1α信号，使用了配备电动阶段的尼康TI-E显微镜和NEO真空冷却的科学CMOS摄像机（Andor Technology）
。使用DAPI ，CY3
，CY5和FITC通道收集图像。核中HIF1α信号的强度被完全量化，并将血红蛋白焦点阴性细胞的平均强度值计为标准化个体值的分母 。 　　将小鼠切除的软骨组织在液氮中冷冻 ，并将其放入OCT化合物（Sakura Finetechnical）中
，并再次捕获冻干
。使用Leica低温恒温器（Leica）获得冷冻的组织切片（6μm厚）。 　　为了检测外源性血红蛋白体，将约3×105 PLC/PR/F5细胞在12孔的板上铺板 ，以I型胶原蛋白（354236
，BD Bioscience）培养12小时 。然后，通过Lipofectamine 2000试剂（11668019 ，Thermo Fisher Scientific）将细胞用PQCXIP – HBB转染，并在6小时后用新鲜的培养基代替
。转染后二十四小时
，用4％多聚甲醛固定细胞。 　　所有样品用4％多聚甲醛固定15分钟，并用5％BSA固定30分钟 ，并与抗体HBB（1:50; PA5-60287
，Invitrogen）和Bodipy（1：1,000; D3822，d3822 ，Thermo Fisher）标记Lipid或strandbrite re green（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1.500;将RNA标记在一个加湿盒子中
，持续1小时，然后用PBS进行三个10分钟的洗涤 。二手抗体施加1小时 ，然后用PBS洗涤3次10分钟
，并用DAPI（Invitrogen）安装抗抗剂试剂
。使用了机动阶段和NEO真空冷却科学CMOS摄像机（Andor Technology）的尼康TI-E显微镜。使用DAPI，CY3和FITC通道使用×60 Apo物镜镜头收集图像 。 　　In vitro liquid phase separation assay was performed using phase buffer (150 mM KH2PO4/K2HPO4 (7778-77-0/7758-11-4, Solarbio) pH 7.35, PEG2000 (25322-68-3, Solarbio) 10%(w/v)) and recombinant haemoglobin α1 (RPD090Mu01, Cloud克隆） ，重组血红蛋白-β（RPD098MU01
，云克隆）
。 　　为了优化条件，将HBB蛋白溶解在DDH2O中至1mgμl -1的浓度 ，然后稀释为最终浓度：62.5
、125、250和500ngμl -1用DDH2O和Buffer（300 mm KH2PO4/KH2PO4/K2HPO4，pH 7.35
，PEG255，PEG2000可变）。将混合物发现在载玻片上 ，并用盖玻片密封 。然后用尼康TI-E显微镜对载玻片进行成像。使用×60 Apo物镜镜头收集图像
。 　　HBB蛋白的浓度为1mgμl -1
，用于体外PEG滴定实验。对于液滴形成，HBB和HBA蛋白的浓度为0.5mgμl -1 。HBB IDR突变体的浓度为1mgμl -1 ，用于体外液滴形成
。所有重组蛋白均购自Detai Bioscience。除PEG滴定实验外
，所有实验均使用缓冲液（150 mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.35和PEG2000 10％） 。 　　通过Solarbio克隆纯化HBB – EGFP重组蛋白 ，将粉末溶解在H2O中为1mgμl -1的浓度
，然后稀释为最终浓度：500ngμl -1用LLPS缓冲液（300 mM KH2PO4/KH2PO4/K2HPO4/k2HPO4），pH 7.35和PEG2000 20％和PEG2000 20％
。 　　对于质粒转染 ，将约6×105 293T细胞在六孔板中铺板
，该板板上有I型胶原蛋白（354236，BD Bioscience） ，并培养12小时。然后用Lipofectamine 2000试剂（11668019，Thermo Fisher Scientific）用相同剂量尊敬的构建体转染细胞
，并在6小时后用新鲜培养基代替 。转染后二十四小时，将细胞在0.1 m的冷PBS中洗涤3次 ，然后将其溶解在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的RIPA缓冲液中
，并通过超声处理碎片
。蛋白质印迹方法的细节如前所述。使用GFP的抗体（1：1,000； 2555，CST）用于识别EGFP标记的HBB及其突变体 。 　　对于质粒转染 ，将约3×105的HEPG2细胞镀在12孔板中
，该板上的12孔板中，用I型胶原蛋白（354236 ，BD Bioscience）培养12小时
。然后根据提供的方案
，用Lipofectamine 2000试剂（11668019，Thermo Fisher Scientific）将细胞用HBB -EGFP表达载体转染。转染十二小时后 ，将细胞培养在玻璃底网格-500菜肴（81168
，IBIDI）上 。转染后36小时，将细胞用2％多聚甲醛（16005 ，Sigma）固定在0.15 m PBS缓冲液pH 7.35 7.35在室温下30分钟。一旦找到了冷凝水的细胞，通过从荧光转换为差异干扰对比模式来记录其在网格上的位置
。荧光成像后
，标记具有正细胞的所选区域以促进电子显微镜的加工。在使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 980）和图像处理进行观察之后，将样品在0.1 m ph 7.4 ph 7.4 artoshate ph 7.4 arthospernewspewnepeply（ZEN 3.6095.01）中以2.5％的2.5％谷氨酸甲醛（25％谷氨酸甲醛； 25％谷氨酸甲醛； 111-30-8 ，Spi）在0.1 m ph 7.4 ph 7.4 arthosphate ph 7.4 arth;用磷酸盐缓冲液洗涤两次
，两次DDH2O洗涤后，用1％OSO4（w/v）和1.5％（w/v）在4°C下固定样品1.5 h 1.5 h ，然后用DDH2O（三次）进行顺序洗涤 。然后将样品用2％UA染色1小时
，然后用DDH2O洗涤3次
。然后，通过与乙醇孵育（30 、50
、70、80 、90和100％两次） ，将样品脱水
，然后与丙酮孵育两次。水合过后，将样品浸润和嵌入步骤 ，其中样品被SPI-PON812树脂（SPI）浸润
，如下所示：3：1，1：1 ，1：1，1：1和1：3丙酮：树脂和100％树脂和100％的树脂
，然后是嵌入48 h处的Resin的样品，然后与Resin一起嵌入并聚合48 h处 ，在60°C下进行嵌入 。最终
，串行超薄部分（厚100 nm） 使用具有自动化（Zhenjiang Lehua Technology）设备的超明核病组（UC7，Leica）形成 ，然后由乙酸铀酰和柠檬酸铅染色
。最终
，使用自动成像软件（自动1.58）的Helios Nanolab 600i双光束SEM（Thermo Fisher）自动获取了串行部分。 　　作为条图显示的定量数据显示平均值±S.E.M.以及在适当的情况下，每个点都代表生物学复制 。使用GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析
。一个未配对的两尾学生的t检验用于确定两组正态分布数据之间的重要性。对于具有一个固定因子的多组之间的比较 ，使用了普通的单向方差分析（ANOVA）
，其次是Dunnett 。单向方差分析遵循Bonferroni的多重比较测试，以将多组与单个对照组进行比较 ，并将每个单元格与对照单元格进行比较
。在一个以上比较具有相同统计范围的情况下
，列出了值从相应面板中从左到右出现的值。精确的样本量，统计测试和P值可以在图图和/或源数据中找到 。对于所有数据 ，当p <0.05时，差异被认为是显着的。所有体内实验进行了至少三个生物学重复
。 　　对于非量化数据（显微照片
，蛋白质印迹等），通过复制实验和/或与正交方法复制实验和/或交叉验证至少复制了三次 ，并显示了代表性的结果。 　　对于所有体内实验
，至少进行了三个生物学重复，并且大多数体外实验至少重复了三次 。对于非量化数据（显微照片 ，蛋白质印迹等）
，通过复制实验和/或与正交方法复制实验和/或交叉验证至少复制了三次，并显示了代表性的结果
。图图中提供了每个确切数量的重复数量的详细信息。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。