硼簇作为宽带膜载体

　　硼簇（作为钠盐）来自Katchem ，硫酸链霉素和卡纳米霉素A单硫酸盐，来自Sigma
，来自Carbosynth的MMAF和Cayman Chemicals的DBET1。肽（WR7和WK7）是由Biosyntan在> 98％纯度中定制的，如HPLC和MS所证实 。如报道51 ，由固相肽合成合成TAMRA-R8。HELA
，HEK293，ARPE-19和A549细胞是从ATCC获得的 ，并从Millipore获得了GT1-7细胞
。在DMEM中
，HELA，HEK293 ，GT1-7和A549细胞在DMEM/F-12中保持在DMEM/F-12中
，在所有情况下，在37°C ，5％CO2和95％的Humities中补充了10％FBS和1％青霉素 - 链霉素 - 云瘤胺混合物。 　　通过用氮气流蒸发脂质溶液制备薄脂质膜
，然后在真空中干燥过夜 。对于zwitterionic囊泡，使用了1 ml Chcl3中的25 mg Eypc ，对于阴离子囊泡，DMPE/DPPG/CHOL（4.4/10.4/10.4/10.4/10.4/10.4/10.4/2.6 mg
，1/2/1摩尔比）在1：1的CHCL3和MEOH（1 mL）中使用
。为了准备脂质/dpx囊泡（其中指示封装），将干膜重新水化（在EYPC的环境温度下在环境温度下30分钟 ，DMPE/DPPG/dppg/chol在55°C下用1 ml缓冲液（5 mm HPTS
，5 mm HPTS，16.5 mm dpx ，10 mm dpx
，10 mm tris，72 mm tris ，72 mM to）在55°C下进行。通过聚碳酸酯膜（孔径100 nm）的冻结 - 透射周期和挤压（15次） 。通过尺寸排除色谱（NAP-25柱SEPHADEX G-25 DNA级）用10 mM Tris
，107 mM NaCl，pH 7.4（EYPC的环境温度 ，DMPE/DPPG/DPPG/CHOL的环境温度为65°C）
，通过尺寸排除色谱（NAP-25柱Sephadex G-25 DNA等级）洗脱牙周成分
。The lipidCF vesicles were prepared analogously, except for the types of rehydration/elution buffers, which were 50 mM CF, 10 mM HEPES, pH 7.5/10 mM HEPES, 107 mM NaCl, pH 7.5 for EYPCCF and 100 mM CF, 10 mM Tris, pH 7.4/10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 forDMPE/DPPG/CHOLCF。 　　将EYPC囊泡储备溶液（5-8 µL）用一次性塑料比色杯中的缓冲液（10 mM Tris，107 mM NaCl ，pH 7.4）稀释，并轻轻搅拌（总体积2,000 µL
，最终脂质浓度13 µm） 。在波长λeM= 511 nm（λex= 413 nm）下以50 s添加硼簇后的时间的函数，在50 s ，100 s的分析物和Triton X-100（24 µL
，1.2％WT/VOL）在600 s添加硼簇后，在600 s添加硼簇后 ，在510 s添加硼簇后
，在51 nm（λEx= 413 nm）中监测HPTS荧光，后者在600 s ，后来以静脉为静脉下
，以此
。将荧光强度标准化为分数发射，为i（t）=（IT -i0）/（i∞ -i0） ，其中i0 =在群集添加之前
，裂解后I∞= IT。对于山坡分析，在裂解之前 ，将其定义为运输活性，y和针对簇（或分析物）浓度
，c，并安装在山丘方程y = y0+（ymax -y0）/（1+（1+（ec50/c）n）中 ，可以使群集的活性
，y0的浓度，ymax ，ymax
，ymax，ymax ，ymax co geflise y 50％
，以达到50％的浓度，以达到50％的活性 ，n 。 　　在激活剂测量值中
，在其中使用同一货物测试了不同的激活剂，激活效率（EA）取决于它们激活不渗透货物分子的运输的能力 ，并以Ymax的最大活性和有效的激活剂浓度为特征
。在低EC50处，有效的激活剂达到高Ymax。为了反映这两个因素
，激活效率定义为EA = Ymax×（PEC50/FA），其中PEC50是EC50的负对数 。为了与文献研究进行比较 ，该研究的旨在将EA值从0到10（参考文献18）进行比较
，将缩放因子FA设置为20.6。 　　在运输测量值中，使用相同的激活剂测试了不同类型的货物 ，运输效率（ET）报告了货物的运输敏感性
，并由Ymax，最大活性和EC50（有效的货物浓度）描述
。易于使用的货物可在低EC50处达到高Ymax。根据ET = Ymax×（PEC50/ft） ，将传输效率定义为两个参数的组成
，其中PEC50是EC50的负对数 。故意将缩放因子ft设置为19.8，以使参考化合物WR7的ET值等于10.0 ，也将量表从0到10设置
。 　　为了用Lipidcf囊泡进行泄漏实验
，将储备溶液（6 µL）用各自的缓冲液稀释在一次性塑料比世中，并轻轻搅拌（总体积2,000 µL ，最终脂质浓度13 µm）。CF fluorescence was monitored at λem = 517 nm (λex = 492 nm) as a function of time after addition of the respective activating or disrupting agent (cluster, WR7 or pyrenebutyrate) at 50 s, and Triton X-100 (24 µl 1.2% (wt/vol)) at 600 s, the latter to lyse the vesicles, for calibration.将荧光强度标准化为分数发射强度，为i（t）=（IT-i0）/（I∞-i0）
，其中i0 =它在破坏剂添加之前和I∞= IT之前，在Triton X-100裂解后I万= IT 。为了对DMPE/DPPG/CHOLCF囊泡的数据分析 ，在Triton X-100裂解之前
，它定义为膜破坏活性，Y ，并绘制为抗化剂的浓度C
，并拟合到山丘方程y = y0+（ymax-y0）/（ymax-y0）/（ymax-y0）/（ymax-y0）/（1+（1+（1+ec50/c）ym），ym和ym ym ym nm ym ，sov ym
，以及ym nm
。 　　U-Tub是自制的，类似于Rebek and Co-Workers52和Matile and Fooders19 ，由一个小型烧杯组成
，中央玻璃屏障将两个水相分开，即顺式（采样阶段）和（接收阶段） ，但可以使氯构层的位置置于CIS和Trans phlofs and Frans phlofs and cis和trans ph and cisis and thercis and thres and thercis and thress and thress and thress and thress and thress and therph。CHCL3的3 mL部分位于U管中，并加入1 mL的顺式和反式相 。有机相在700 r.p.m.在室温下
。从水相位的等分试样（20μl）在不同时间取下
，用缓冲液（10 mM Tris，107 mM NaCl ，pH 7.4）稀释至450μl
，并通过荧光测量。 　　所有实验均在微局部，大气压和25°C的VP-ITC微氧化电脑中进行 。溶液在Thermovac附件进行滴定实验之前进行脱气和恒温
。将恒定体积的B12BR122-（每次注射10 µL）注入水中的肽溶液（WR7或WK7）中 ，以确定B12BR122-与肽的明显结合亲和力。通过将B12BR122-滴定到水中并从反应热中减去稀释热 。通过使用一组位置模型获得复杂的稳定性常数（KA）和摩尔反应焓（ΔHº）
，将整洁的反应热与原点V.7.0和V.8.0软件拟合。根据关系ΔGº= -Rtlnka =ΔHº -TδSº获得自由能（ΔGº）和熵变化（ΔSº）
。 　　DLS实验是在Malvern Instruments DTS Nano 2000 Zeta-Sizer上进行的。请注意，B12BR122-簇与不同cargos的组合的DLS测量未显示任何可检测到的DLS可测量尺寸颗粒的信号 。 　　对于共聚焦显微镜研究 ，前一天将HeLa细胞播种在µ-SLIDE 8孔（同上）上
，每孔的密度为30,000个细胞
。将簇和/或肽稀释在HKR缓冲液中（5 mM HEPES，137 mM NaCl ，2.68 mM KCl
，2.05 mgCl2，1.8 CaCl2 ，pH 7.4），并添加到先前用HKR洗涤的细胞中。将HELA细胞与TAMRA-R8（1 µm）和HKR缓冲液中的三分之一的簇在37°C
，5％CO2中孵育1小时，用DMEM洗涤 ，无需苯酚红色
，并立即使用融合软件（Andor）与龙珠旋转的Microscope旋转式摄像机在nikon Eclipse ti-e and and andermecem scm and Andere and Anky and Ampormos scyla and andor sacky and Ampormos and Ampormose 。对于欺骗素的递送研究，将HELA ，GT1-7
，ARPE-19和A549细胞与腓罗蛋白-TRITC和硼簇孵育3小时，然后将核用1 µM Hoechst 33342染色 ，直到20分钟
。图像用斐济诉2.1.0/1.53e（参考文献53）处理。 　　对于在簇和Tamra-R8存在的MTT测定中
，前一天将HeLa细胞播种在96孔板中，每孔10,000个细胞 。在存在或不存在1 µM TAMRA-R8的情况下 ，将细胞与溶解在DMEM中的簇孵育1小时
。孵育混合物被DMEM+10％FBS+0.5 mg ML – 1 MTT代替。对于在B12BR122-或R8存在下的生存力测定中
，前一天在96孔板中以每孔的6,000个细胞为6,000个细胞，将HELA ，GT1-7，ARPE-19和A549细胞播种 。将细胞与溶解在HKR缓冲液中的B12BR122-或R8孵育3小时
，然后与完整的培养基一起孵育24小时，然后与完整的培养基和0.5 mg ML -1 MTT孵育
。为了在MMAF存在下的生存力研究 ，将HeLa细胞与MMAF和B12BR122-在DMEM（无血清或抗生素）中稀释3小时孵育3小时。用0.1 mg ml -1肝素洗涤细胞
，并在完整的培养基中进一步孵育21小时，并在包含0.5 mg ml -1 mtt的完整培养基中进行2小时 。对于所有类型的测定 ，在孵育2小时后
，小心地去除培养基，并通过添加DMSO溶解甲层。用板块读取器（Tecan Infinite F200Pro）测量570 nm处的吸光度 ，并将数据归一化为未处理细胞的值（100％活力）
。用r（v。4.0.3）54分析数据 。 　　将大肠杆菌TOP10细胞的预培养在LB培养基中以50 µg ML -1硫酸链霉素孵育过夜
。第二天
，在不同浓度的卡纳米霉素A单硫酸盐（0 、2.5、3或3.5 µg mL-1）和B1222-（0
、500、500 、750或1,000 µM中的semcin in she She She She Knekery Ingromecin）中，将在costar培养96孔培养中生长103-104个菌落形成单位。18小时后 ，用Tecan Infinite F200Pro微板读取器测量了570 nm处的光密度作为细菌生长的指标 。相对于没有抗生素的对照条件
，将每种B12BR122-浓度的数据标准化
。 　　该测定是根据制造商（Promega）协议进行的，并需要适应载体。使用Lipofectamine 2000将HEK293细胞与质粒共转染了纳米核-CRBN和DDB1表达 。将细胞胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶进行 ，重悬于Opti-MEM I中，每mL 200,000个细胞
，每毫升200,000个细胞，34μL在白色的 ，非结合表面板上（corning）
。以1,000×浓度在DMSO中制备DBET1系列稀释液
，并在Opti-Mem I至20倍中进一步稀释。将B12BR122-在Opti-Mem I中稀释至20倍，并将1：1与DBET1溶液混合 。将2μl的纳米芯靶示踪剂CRBN试剂（最终浓度 ，0.5μM）和4μL的DBET1/B12BR122-混合物添加到细胞中
，该细胞在37°C下孵育2小时
。制备完整的底物抑制剂溶液，并使用Tecan Infinite 200Pro读板读取器（过滤器blue2和Red；整合1 s）测量生物发光谐振能量转移（BRET）。通过在没有示踪剂的情况下减去样品信号进行背景校正 。将每个B12BR122-浓度序列的值标准化为没有DBET1的对照的BRET读数。用R（v.4.0.3）54分析数据
。 　　胞质提取物是根据先前描述的方案55与digitonin孵育（一种固醇皂苷 ，优先渗透富含胆固醇的膜（如质膜）
，对细胞内膜的影响较小，从而获得了胞质提取物。简而言之 ，将HELA细胞以每孔的260,000个细胞在六孔板中的260,000个细胞播种
，第二天用HKR洗涤两次，与1 µM Tamra-R8（映体）一起孵育 ，在存在或不存在10 µm B12BR122-的情况下，用HKR两次将其洗净10 µm B12BR122-
，将其煮成两次，并与2 mg mg mg mg mg mg mg mg mg Mg Mg Mg Mg Mg Mg Mg Me Heparin一起洗涤 。镁
。将细胞与600 µL的35 µg ml -1 digitonin在PBS CA/mg中孵育10分钟 ，将上清液与收集的胞质分数和细胞用200 µL PBS CA/mg洗涤
，将此上清液与先前的提取物混合在一起。通过在PBS中将细胞与800 µL的1％Triton X-100孵育来收集非胞质分数 。提取物的TAMRA荧光在板读取器（Tecan Infinite 200Pro，λEx= 555 nm ，λem= 585 nm）中测定
，并通过使用具有TAMRA-R8连续稀释的校准曲线来计算浓度
。对于互补的HPLC分析，将磷酸盐缓冲液替换为TBS（20 mM Tris -HCl ，pH 7.2
，150 mM NaCl，0.5 mM CaCl2 ，0.5 mM MMMGCL2）和Digitonin提取
，如上所述。这些提取物的等分试样用于β-己糖胺酶活性的测定 。将胞质提取物冻干并重悬于1:10的H2O：CH3CN 1：1的1％TFA中，并通过HPLC（RP-HPLC Agilent Luna 5u C18100Å（5→20分钟））通过监测TAMRA发色团的555 nm吸光度
。 　　分馏的质量通过溶酶体β-己糖胺酶的活性评估 ，使用4-硝基苯基2-乙酰基-2-脱氧-2-脱氧-β--葡萄吡喃糖苷作为底物。简而言之，将20 µl提取物与80 µL的7.5 mm底物在100 mM柠檬酸盐缓冲液中孵育
，pH 4.7，在37°C下孵育40分钟 ，并通过添加200 µL 0.2 m Tris溶液来停止反应 。在板读取器中测量405 nm处的吸光度
。作为空白
，仅使用包含底物的井。在肽存在的存在下，酶促活性为3.2±2.0％ ，在存在肽和簇的情况下为5.4±1.0％
，证实了胞质级分的较高纯度 。 　　前一天，在六孔板中以每孔为单位260,000个细胞播种 ，用HKR洗涤3小时
，每孔2.5 mL 2.5 ml，每孔50 µm的每个硼簇在HKR中稀释。用含有0.1 mg ML -1肝素的HKR洗涤细胞 ，用HKR两次
，然后用浓硝酸裂解（69％HNO3）
。为每个样品合并了来自九口井的细胞。通过ICP-MS在配备了Micromist玻璃低流量雾化器，带有毛皮物系统（2°C）和石英火炬的双通喷雾室的安捷伦7700倍分析之前 ，将裂解物稀释 。用元素（GE）作为内标，制备10至1,000μgl -1之间的元素硼（B）的校准曲线
。ICP-MS仪器参数如下：RF功率
，1,550 W；样品深度，8毫米；载气流量为1.1 L min -1;雾化器泵速度为0.1 R.P.S。;S/C温度 ，2°C 。设置其他参数如下：提取1
，0;提取2，-175;欧米茄偏见 ，-100；欧米茄镜头
，12.6；细胞入口，-40;细胞出口 ，-60;偏转
，0.4；板偏，-60;QP偏见 ，-15;十月RF
，180；OCTP偏置，-18;他的汽油为3.6；判别器 ，4.5 mV；模拟HV，1,730 V;脉冲HV
，954 V. 　　在96孔板中，将HeLa细胞以每孔10,000细胞的形式接种
。第二天 ，将它们与在HKR中稀释的指定化合物一起孵育1小时。随后将细胞用含0.1 mg ml -1肝素的HKR洗涤5分钟
，并再次用HKR洗涤并胰蛋白酶素化 。用含有2％FBS和5 mM EDTA的PBS中和胰蛋白酶中和
。用绿色激光器（532 nm）激发了塔姆拉荧光，并在Guava Easycyte BG HT上测量 ，以620/52 nm（橙色G通道）收集发射
，并使用Incyte v.3.2（Guavasoft，Millipore）。用R（v.4.0.3）54分析数据 ，并选择了CytoPlorer（V.1.0.8）56和GGCYTO（v.1.18.0）57个细胞57个具有典型FSC和SSC参数的细胞
，并选择了每个样品计算的中间荧光强度 。每种条件是一式三份测量的
。 　　如前所述51，使用FMOC-环酰胺树脂（负载为0.19 mmol G-1）通过手动FMOC固相肽合成合成Tamra-R8 ，如前所述51。RP-HPLC纯化后获得tamra-r8
，总产率为17％（15 mg），纯度为99％ 。它在RP-HPLC Agilent SB-C18色谱柱上的特征是H2O（0.1％TFA）/CH3CN（0.1％TFA）95：5→5：95：95（0→12分钟）]。RT ，5.96分钟
。MS（ESI）：1,124.7（9，[M+2H+4TFA] 2+）
，1,067.9（17，[M+2H+3TFA] 2+） ，1,011.0（14
，[M+2H+2H+2TFA] 2+）[M+3H+2TFA] 3+），636.3（95 ，[M+3H+TFA] 3+）
，598.2（36，[M+3H] 3+） ，534.5（24
，[M+4H+3TFA] 4+），4+） ，506.0
，506.0（36，[3 ，[M+4H+2TFA]，47
，47，47。[M+4H+TFA] 4+） ，449.1（62
，[M+4H] 4+） 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。