Dock2参与了严重的Covid-19的宿主遗传学和生物学

　　通过JCTF招募了COVID-19受影响的所有病例 。我们使用临床表现和PCR测试结果招募了住院的患者 ，该患者在2020年4月至2021年1月（GWAS）或2021年2月至2021年9月之间在100多家附属医院中招募了临床表现和PCR测试结果
。需要氧气支持
，人工呼吸和/或重症监护病房住院的患者被定义为“严重的COVID-19”，而其他患者则被定义为“非重生Covid-19 ”。补充表2提供了临床表现的详细信息 ，包括心血管和呼吸合并症 。根据日本的临床管理指南
，选择了65岁的阈值65岁
。从大阪大学的日本普通人口和附属机构（用于GWAS和复制）或生物银行日本Project38（用于复制）收集对照对象。如在其他位置上所述，将确定为非日本起源的个体被排除在外（图2A） 。所有参与者均经过附属机构的道德委员会批准的书面知情同意书（Keio IRB批准20200061 ，大阪大学IRB批准734-14
，Tsukuba University of Tsukuba IRB批准H29-294）
。 　　我们使用Infinium Asian筛选阵列（Illumina）对2,520例Covid-19病例和3,341例对照进行了GWAS基因分型。我们将严格的质量控制（QC）过滤器应用于样品（样本呼叫率< 0.97, excess heterozygosity of genotypes >平均+3×s.d.，具有PI_HAT> 0.175的相关样品 ，或者来自East Asian簇的离群样本，用于主成分分析中的1000个基因组样本）和变体（变体呼叫率< 0.99, significant call rate differences between cases and controls with P < 5.0 × 10−8, deviation from Hardy–Weinberg equilibrium with P < 1.0 × 10−6, or minor allele count <5). Details of the QC for the mitochondrial variants are described elsewhere40. After QC, we obtained genotype data of 489,539, 15,161 and 217 autosomal, X-chromosomal and mitochondrial variants, respectively, for 2,393 COVID-19 cases and 3,289 controls. 　　We used SHAPEIT4 software (version 4.1.2) for haplotype phasing of autosomal genotype data, and SHAPEIT2 software (v2.r904) for X-chromosomal genotype data. After phasing, we used Minimac4 software (version 1.0.1) for genome-wide genotype imputation. We used the population-specific imputation reference panel of Japanese individuals (n = 1,037) combined with 1000 Genomes Project Phase3v5 samples22 (n = 2,504). Imputations of the mitochondrial variants were conducted as described elsewhere40, using the population-specific reference panel (n = 1,037). We applied post-imputation QC filters of MAF ≥ 0.1% and imputation score (Rsq) > 0.5, and obtained 13,116,003, 368,566 and 554 variants for autosomal, X-chromosomal, and mitochondrial variants, respectively. We note that the genotypes of the lead variant in the GWAS (rs60200309) were obtained by imputation (Rsq = 0.88). We assessed accuracy by comparing the imputed dosages with WGS data for the part of the controls (n = 236), and confirmed high concordance rate of 97.5%. 　　We conducted GWAS of COVID-19 by using logistic regression of the imputed dosages of each of the variants on case–control status, using PLINK2 software (v2.00a3LM AVX2 Intel (6 July 2020)). We included sex, age, and the top five principal components as covariates in the regression model. We set the genome-wide association significance threshold of P < 5.0 × 10−8. 　　HLA genotype imputation was performed using DEEP*HLA software (version 1.0), a multitask convolutional deep learning method14. We used the population-specific imputation reference panel of Japanese donors (n = 1,118), which included both classical and non-classical HLA gene variants for imputation13. Before imputation, we removed the overlapping samples between the GWAS controls and the reference panel (n = 649), from the GWAS data side. We imputed HLA alleles (two and four digit) and the corresponding HLA amino acid polymorphisms, and applied post-imputation QC filters of MAF ≥ 0.5% and imputation score (r2 in cross-validation) > 0.7. 　　As for the imputed HLA variants, we conducted (1) association test of binary HLA markers (two- and four-digit HLA alleles) and (2) an omnibus test of each of the HLA amino acid positions, as described elsewhere13. Binary maker test was conducted using the same logistic regression model and covariates as in the GWAS. Omnibus test was conducted by a log likelihood ratio test between the null model and the fitted model, followed by a χ2 distribution with m − 1 degrees of freedom, where m is the number of residues. R statistical software (version 3.6.0) was used for the HLA association test. We set the HLA-wide significance threshold based on Bonferroni’s correction for the number of the HLA tests (α = 0.05). 　　We estimated the ABO blood types of the GWAS subjects based on the five coding variants at the ABO gene (rs8176747, rs8176746, rs8176743, rs7853989 and rs8176719)41. We phased the haplotypes of these five variants based on the best-guess genotypes obtained by genome-wide imputation, and estimated the ABO blood type as described elsewhere15. We were able to unambiguously determine the ABO blood type of 99.1% of the subjects. 　　Blood-group-specific odds ratios were estimated based on comparisons of A versus AB/B/O, B versus A/AB/O, AB versus A/B/O and O versus A/AB/B. We conducted a logistic regression analysis including age, sex and the top five principal components as covariates. R statistical software (version 3.6.3) was used for the ABO blood type analysis. 　　We conducted two-sample Mendelian randomization analysis as described elsewhere17,42. As exposure, we selected a series of clinical states where altered comorbidity with COVID-19 have been discussed. As an outcome phenotype, we used the GWAS summary statistics of Japanese (current study) and European (release 5 from COVID-19 HGI3) participants. Lists of the Japanese and European GWAS studies used as the exposure phenotypes are in Supplementary Table 6. We extracted the independent lead variants with genome-wide significance (or the proxy variants in linkage disequilibrium r2 ≥ 0.8 in the EAS or EUR subjects of the 1000 Genomes Project Phase3v5 databases) from the GWAS results of the exposure phenotypes. We applied the inverse variance weighted method using the TwoSampleMR package (version 0.5.5) in R statistical software (version 4.0.2). 　　We genotyped additional 1,243 severe COVID-19 cases and 3,769 controls using Infinium Asian Screening Array (Illumina). We applied the QC filters and genotype imputation, and conducted case–control analysis of the variant as in the same manner as the GWAS. 　　We incorporated 475 patients with COVID-19 recruited at the core medical institutes of JCTF and included them in the GWAS for the bulk RNA-seq analysis (Supplementary Table 2). Isolation of RNA from the peripheral blood of the COVID-19 patients was conducted using RNeasy Mini Kit (Qiagen). Libraries for RNA-seq were prepared using NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module and NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs). RNA-seq was performed using the NovaSeq6000 platform (Illumina) with paired-end reads (read length of 100 bp), using S4 Reagent kit (200 cycles). We obtained on average 71,724,142 ± 17,527,007 reads per a sample (mean ± s.d.). Sequencing reads were quality-filtered, and adapter removal was performed using the Trimmomatic (v0.39)43. Alignment to the human reference genome GRCh38/hg38 was performed using STAR (v2.7.9a)44, based on the GENCODE v30 annotation. Gene level quantification and normalization was using RSEM (v1.3.3)45. TPM was used as an index of gene quantification. We excluded the two outlier samples in the principal component analysis plot of the TPM from the analysis (n = 473 for the analysis). We quantified 58,825 genes, and adopted the 5,991 genes with median TPM >10进行后续分析 。 　　In the eQTL analysis of the DOCK2 variant, dosage effects of the risk variant (rs60200309-A) on the gene expression levels (TPM) were evaluated using linear regression models with age, sex, severity, the top ten principal components of the TPM matrix, and the top 5 pricipal components of the GWAS data as covariates.还评估了风险变体对位于500 kb窗口内附近基因表达的剂量效应。R统计软件（3.6.3版）用于分析
。GWAS和DOCK2 EQTL信号之间的共定位分析是使用Ecaviar23进行的。 　　对从Covid-19患者的外周血分离的RNA进行了实时QPCR（n = 468） 。使用高容量RNA-CDNA cDNA试剂盒（Life Technologies）对总RNA进行反转录
。实时QPCR是使用7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems;探针测定ID：HS00386045_M1（DOCK2）和HS9999999905_M1（GAPDH）进行实时QPCR。在严重和非严重的COVID-19和四个Covid-19疾病严重程度等级之间进行了差异表达分析
，从无症状>轻度>严重>最严重进行了排序 。在严重的COVID-19中，重症监护或需要插管和通气的患者被归类为“最严重
”的疾病 ，其余的疾病被列为“严重”疾病
。在非严重的covid-19中
，与Covid-19有关的没有任何症状的患者被列为“无症状 ”疾病，而其他患者则被列为“轻度
”疾病。使用与年龄的线性回归模型一起对相对于GAPDH的相对DOCK2 mRNA表达进行分析 ，并在R统计软件中作为协变量（版本3.6.3） 。 　　从严重的Covid-19（n = 30）的患者和在大阪大学医学院招募的健康对照组（n = 31）的患者获得外周血样本
。在30例COVID-19患者中
，有5例被归类为中度，根据疾病的严重程度 ，根据世界卫生组织（WHO）序列量表的最高分数
，根据疾病的严重程度被归类为严重，以进行临床改善。对于COVID-19和健康对照组的患者 ，根据制造商的说明
，使用Leucosep（Greiner Bio-One）密度梯度离心分离出血液中的血液中的血液 。对于所有样品收集3小时内处理血液，并保存在-80°C下直至使用
。 　　按照铬单细胞V（d）J试剂盒（V1.1化学）用户指南中概述的协议 ，通过10倍基因组铬控制器（10倍基因组学）处理单细胞悬浮液。在此过程中，铬在此过程中应用了下一个宝石单细胞5'库和凝胶珠套件v1.1（PN-1000167）
，铬铬下一个宝石芯片G单细胞试剂盒（PN-1000127）和单个索引套件T集A（PN-1000213） 。根据制造商的建议，每个样品分别将大约16,500个活细胞分别加载到铬控制器的每个端口中 ，而没有样品混合
，以生成10,000个单细胞凝胶螺母乳液以进行库的准备和测序。随后在Veriti热循环仪（Thermo Fisher Scientific）中对包裹的单细胞和条形码珠的油滴进行反向转录，从而导致用细胞条形码和独特的分子索引（UMI）标记为cDNA
。接下来 ，将cDNA放大以根据制造商的协议生成单细胞库。用敏捷生物分析仪高灵敏度DNA分析（Agilent
，高敏感性DNA试剂盒，5067-4626）进行定量 。随后将放大的cDNA酶上碎片 ，末端修复和polya标记
。使用Spriselect磁珠（Beckman-Coulter
，Spriselect，B23317）在放大cDNA上进行清理和尺寸选择。接下来 ，将Illumina测序适配器连接到尺寸选择的片段
，并使用Spriselect磁珠清理 。最后，选择样品指标并放大 ，然后使用Spriselect磁珠进行双面尺寸选择
。使用Agilent Bioanalyzer高灵敏度DNA分析评估最终图书馆质量。然后将样品在NovaseQ6000（Illumina）上测序为配对末端模式，以达到每个细胞至少20,000个配对末端读取的基因表达 。 　　使用Cell Ranger 5.0.0（10x基因组学）处理液滴库
。使用GRCH38人参考基因组将测序读数与Star（v2.7.2a）44对齐。计数矩阵是使用Dropest46从生成的BAM文件中构建的 。少于1,000 UMI或大于20,000 UMI的细胞以及包含超过10％的线粒体或血红蛋白基因读取的细胞被认为是低质量并从进一步分析中取出的细胞
。另外
，对于每个样品47，使用scrublet（v0.2.1）去除了假定的双重运动员。 　　R包Seurat（v3.2.2）用于数据缩放 ，转换
，聚类，降低降低 ，差分表达分析和大多数可视化48 。使用SCTRANSFORM（）函数对数据进行缩放和转换
，并进行线性回归以消除由于细胞质量（线粒体读数的百分比）而导致的不良变化。为了进行集成，我们使用SelectIntegrationFeatures（）函数确定了3,000个共享高度可变基因（HVG）
。然后 ，我们使用FindIntegrationCance（）函数在这些基因的基础上识别了单个数据集之间的“锚”
，并将这些锚点输入到IntegratedAta（）函数中，以创建所有单元格的批处理校正的表达矩阵。对主成分分析和UMAP尺寸减小了30个主组件49 。使用findneighbors（）函数计算了使用主要组件分析的30个维度的最接近的纽布图 ，然后使用FindClusters（）函数进行聚类
。 　　通过使用findmarkers（）函数为“ test.use = wilcox ”找到差异表达的基因
，并将这些标记与已知的细胞型特异性基因进行比较（扩展数据图7a），确定了细胞身份。我们获得了12个细胞簇 ，使用方位角进一步证实了这些簇（图2D和扩展数据图7a，c）50 。从12个簇定义了六种主要的细胞类型
，如下所示；CD4+ T细胞和Treg细胞被注释为CD4T；将CD8+ T细胞和增殖T细胞注释为CD8T；天然杀伤细胞被注释为NK；B细胞和浆膜作为B注释；CD14+单核细胞和CD16+单核细胞被注释为单核细胞；将常规的树突状细胞和PDC注释为树突状细胞
。为了阐明DOCK2的免疫细胞类型表达，我们使用Nebulosa R软件包（V1.0.0）51的Plot_denty（）函数制作了密度图 ，并使用dotplot（）函数进行了点图。 　　提取并重新整合标记为先天免疫细胞簇（CD14+单核细胞
，CD16+单核细胞以及常规和PDC）的液滴，并重新整合使用与上述相同的程序进行进一步的亚集群 ，除了使用2,000个共享HVGS 。积分后
，如上所述进行了聚类和群集注释（扩展数据图7b）
。 　　在患有严重的COVID-19的患者和每种细胞类型的健康对照患者之间进行了差异基因表达分析。首先通过在每个样品中的每种细胞类型的基因计数中汇总基因计数来创建供体伪泡样样品 。在分析中，包括109名患者或每种细胞类型的健康对照组中表达速率的基因超过10％
。使用BioConductor套件EDGER（v3.32.0）52中实现的NB GLM进行差异基因表达测试。 　　我们应用了加权基因共表达网络分析（WGCNA）算法28来评估COVID-19中与DOCK2共表达基因 。使用SCRAN（v1.18.5）53患者的非经典单核细胞的伪泡归一化数据用于WGCNA分析 ，如果在超过1％的covid-19患者的非经典单核细胞中表达了1％以上的细胞中
，则选择基因。我们使用“未签名网络
”选项和软阈值功率计算了邻接矩阵设置为5的柔软阈值功率，由tomsimiality创建的拓扑重叠矩阵 ，通过hclust fiage fiage of tomsimiality通过hclust对1-汤姆（Tom）用方法=“平均”
，并通过以下参数进行了动态树；deepSplit = 4，minclustersize = 30
。我们使用函数富集（pvaluecutoff = 0.01 ，padJustMethod =“ bh ”，orgdb =“ org.hs.eg.db”
，ofg.hs.eg.db“，ont =“ bp
”） ，ClusterProfiliLER（V3.14）。 　　我们应用伪块方法进行单细胞EQTL分析 。首先
，我们使用SCRAN（V1.18.5）53进行了单细胞级别的归一化
。然后将每个样品每个细胞类型的基因表达计算为跨细胞的log2转换计数的平均值。对于主成分分析，如果在非经典单核细胞中超过1％的细胞中表达基因 ，则将采用基因 。 　　在对DOCK2变体的EQTL分析中
，使用年龄，性别 ，性别
，疾病严重程度（仅包括在COVID-19分析中包括在内的前两个PCS中，危险变体（RS60200309-A）对基因表达的剂量效应（RS60200309-A）对基因表达的剂量效应进行了评估
。R统计软件（版本4.0.2）用于分析。 　　通过淋巴细胞密度梯度从三个健康供体的血液中分离出PBMC 。使用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）通过阴性选择纯化PDC
。为了评估干扰素-α的生产能力 ，用30μgml-1 CpG-A ODN（D35；基因设计
，日本）或对照刺激排序的PDC。使用Verikine-HS人干扰素α所有亚型TCM ELISA试剂盒（PBL）刺激后12小时评估IFNα 。使用配对t检验评估了两组之间IFNα产生的差异
。 　　通过淋巴细胞密度梯度从19位健康供体的血液中分离出PBMC。CD3+ T细胞通过磁激活的细胞分选（MAC）分选 。在100μLRPMI + 0.5％BSA培养基（100μm；英国Tocris）中，CD3 + T细胞（1.0×105）放在Transwell的上腔（5 µm孔径；过山车）中。下部腔室中填充了400 µL RPMI培养基 ，这些培养基添加了CXCL12（100 ng ml -1; R＆D系统），并在37°C下孵育2小时
。使用FACS收集并分析了迁移到下腔的细胞。使用以下单克隆抗体进行FACS分析：抗人CD3（UCHT1； BD Biosciences）和CD4（SK3； BD Biosciences）抗体 。使用僵尸染料（Biolegend）排除死细胞
。用LSR Fortessa（BD Biosciences）获取事件
，并使用FlowJo软件（BD Biosciences）进行分析。使用配对t检验评估了CXCL12组和CXCL12 + CPYPP组之间趋化性的差异 。 　　将Thp1蓝色ISG（Invivogen）细胞培养在10％FBS，2 mM-谷氨酰胺 ，25 mM HEPE中
。为了生成慢病毒载体
，宽叶v2表达指南RNA/cas9（参考文献55），GAG-POL包装质粒PSPAX2（Addgene＃12260）和PMD2.G（Addgene＃12259）使用X-Treme 9 DNA Transfection（dna dna Transfection）共同转化至293T细胞。在补充表11中 ，用于DOCK2的指南RNA和潜在的脱靶效应评估56,57 。在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养了转染的293T细胞
，其中具有10％的FBS和10％的FBS和50单位，每ML青霉素/链霉菌素
。转染后12小时更换培养的培养基。在另外36小时后收集含病毒的上清液 ，并通过0.45μm孔径纤维素乙酸滤料过滤器（Sigma-Aldrich）过滤 。然后
，将2×106 THP1蓝色ISG细胞培养在2 mL聚甲烯（8 µg ml-1，Millipore）/含病毒的培养基中
。孵育24小时后 ，收集感染的具有含病毒培养基的THP1蓝色ISG细胞
，离心（400G，4分钟） ，并在新鲜培养基中培养。为了选择扁豆表达细胞，将感染的细胞培养4天
，在感染后2天，在补充1μg/ml紫霉素的培养基中培养4天 。通过定量实时PCR分析和Western印迹（ABCAM AB124848）评估了Dock2敲低效率。THP1单核细胞与20 ng ml-1 phorbol的72 h孵育12-饱和13-乙酸酯（PMA ，Sigma
，p8139）
。使用Verikine-HS人干扰素alpha所有亚型TCM ELISA KIT（PBL），刺激后6小时评估IFNα（3μgml-1 CpG-A ODN（D35 ，Gene Design）或对照ODN（D35
，GC））。 　　肺和肺淋巴结的患者样本是在Covid-19-19肺炎死亡后的尸检中获得的（样品1-3）和非covid-19-19肺炎（样品4和5） 。为了染色对照样品，从肺癌引起的手术切除的肺样本中获得了肺和淋巴结组织切片
。DOCK2的免疫组织化学是根据标准程序进行的。简而言之 ，将5μM的福尔马林固定石蜡嵌入的组织切片脱蜡 。使用压力烹饪（在柠檬酸盐缓冲液中持续3分钟）进行抗原检索
。内源性过氧化物酶活性通过将3％过氧化氢的切片孵育5分钟来阻断。阻塞后
，将组织切片与以1：1,000稀释的抗Dock2兔多克隆抗体58孵育 。来自Dako（Glostrup）的Envision套件用于检测染色
。 　　SARS-COV-2（JPN/Kanagawa/Kuh003）33，用于Covid-19的实验动物模型。将等分试验的等分试样储存在-80°C直至使用 。 　　CPYPP是DOCK2 -RAC1相互作用的抑制剂29 ，是从Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）获得的
。CPYPP溶解在DMSO中。 　　遵循所有适用的国家和机构指南
，遵循动物的护理和使用 。动物实验方案通过基塔萨托大学的机构动物护理和使用委员会的判决得到了基塔萨托大学校长的批准（批准第21-007号）。根据我们在SARS-COV-2感染模型的经验确定样本量，并使用了最小动物数量
。 　　我们计划并执行了扩展数据中显示的实验时间表图10a。六周大的叙利亚仓鼠（Clea Japan）维持在基塔萨托大学兽医学系的生物安全3级实验动物设施中 。将63只动物分为四组：SARS-COV-2+CPYPP（n = 29）；SARS-COV-2+车辆（n = 28）;模拟+cpypp（n = 3）;和模拟+车辆（n = 3）
。仓鼠在SARS-COV-2或仅在100μl的体积中仅在SARS-COV-2或仅在SARS-COV-2或培养基（模拟感染）的105.8中位组织培养剂剂量（TCID50）中接种仓鼠。5分钟（0 dpi）和24 h（1 dpi）后 ，将仓鼠注入腹膜内，向CPYPP（每个8.4 mg; 0.2 ml）或DMSO（车辆; 0.2 mL）注入 。所有仓鼠每天都称重
。SARS-COV-2感染的仓鼠以3 、6或11 DPI（每组3和6 DPI动物为8只动物
，在11 dpi中每组6只动物）进行安乐死，然后收集鼻拭子和组织。安乐死后从胸腔器官中解剖肺 ，并在DPI 0
、3、6和11时测量肺部重量 。使用两边的Welch的T-test评估了SARS-COV-2+CPYPP组和SARS-COV-2+CPYPPS组和SARS-COV-2+CPY-2+车辆组之间体重差异和肺重量的差异
。仓鼠在到达人道终点时或接种SARS-COV-2后的11天被安乐死。人道端点（体重减轻> 25％）基于先前的研究34 。 　　感染了CPYPP或媒介物的叙利亚仓鼠在3 、6或11 DPI中安乐死（n = 3）
。对用CPYPP或媒介物接种SARS-COV-2的仓鼠肺的组织病理学检查是通过血久毒素和曙红染色进行的。如其他地方所述
，评估了受感染的仓鼠的病理严重程度评分 。简而言之，根据使用以下评分系统 ，根据每组中每一组从每只动物收集的最大切割表面的炎症面积百分比进行评分：0
，无病理性变化；1，受影响区域（≤10％）；2 ，受影响区（<50%, >10％）;3
，受影响区域（<90％，≥50％）；4（≥90％）观察到肺水肿和/或肺泡出血时增加一个点。显示了单个动物的总分
。根据标准程序进行肺泡巨噬细胞的免疫组织化学。简而言之 ，将感染的叙利亚仓鼠的FFPE肺组织与1：400稀释的抗CD68小鼠多克隆抗体孵育（ABCAM AB125212） 。Envision套件（DAKO）用于检测染色
。 　　根据制造商的说明
，使用Qiaamp病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen）提取鼻拭子的总RNA。通过使用多孔冲击器（Yasui Kikai）添加QIAAMP病毒RNA迷你试剂盒的RLT缓冲液，将每个器官匀浆 。在10,000 rpm的10％（w/v）组织匀浆10分钟后 ，使用上述试剂盒从回收的上清液中提取RNA
。使用Thunderbird Probe Onestep QRT-PCR（Toyobo）和底漆/探针N2 2019-NCOV（TAKARA）检测到SARS-COV-2的核素（N）基因。为了量化SARS-COV-2 N基因拷贝，使用阳性对照RNA Mix 2019-NCOV（TAKARA）生成标准曲线 。用Ferren等人的修饰评估了肺细胞因子表达谱（IFN
，IL6和趋化因子）
。59。简而言之，用Revertra Ace QPCR RT Master Mix（Toyobo）将100 ng的RNA转换为cDNA 。使用Thunderbird Probe QPCR混合物（Toyobo）进行QPCR
。补充表12列出了所使用的引物和探针。使用QuantStudio 1实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）在重复项中对所有样品进行了反应 ，并用GAPDH作为参考基因将靶mRNA表达水平归一化 。与未感染的仓鼠相比
，使用QuantStudio设计和分析软件（Thermo Fisher Scientific）计算了受感染仓鼠的相对表达水平（折叠变化）。使用两侧Wilcoxon秩和测试评估两组病毒载量和肺细胞因子表达谱的差异
。 　　图2M，n显示了Covid-19肺炎中DOCK2免疫组织化学分析的代表性图像 ，并且在没有Covid-19或肺炎的对照中。扩展数据图9显示了本研究中检查的所有尸体尸体或手术标本 。为了进行免疫组织化学分析
，在每个样品中至少三个肺和肺淋巴结节点上进行了所有实验，并确认了相似的结果
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。