一种用于生产抗癌药物替代的微生物供应链

　　所有化学标准（补充表2）的纯度为95％或更高。 　　VMI8HGO-A的序列使用BlastN42和C. roseus 8HGO-A序列（GenBank登录号AHK60836.1）作为查询获得 。使用TransDecoder（http://transdecoder.github.io）预测开放式阅读帧。 　　所有质粒均由用户克隆43或限制性酶克隆构建 ，然后化学转化为大肠杆菌DH5α竞争细胞，并将其镀在含有100μgml -1氨基氨基氨基氨基氨基蛋白的luria -bertani琼脂上
，并在37°C的生长（16-20 h）
。通过菌落PCR对大肠杆菌转化体进行基因分型，并在5 ml的luria -bertani培养基中生长具有正确插入的菌落 ，在37°C下含有100μgml -1氨苄青霉素16-20小时
，持续16-20小时，然后进行微型质粒提取并通过sanger sequencect验证。所有生物合成基因（补充表1）均已优化酵母表达的密码子 ，并通过IDT或Twist Biosciences合成 。通过用户克隆
，将所有基因组装成centromeric（PRS系列）或2-μm（PESC系列）质粒的表达盒
。通过用户克隆将20-核苷酸指导RNA序列构建到具有LEU2或URA3选择标记物的2-μm载体中，从而构建了单个指导RNA质粒。通过用户组装的所有指导-RNA表达盒从单个指南-RNA质粒扩增的所有指南-RNA表达盒 ，构建了几种引导RNA质粒 。通过插入的Sanger测序验证了所有质粒（补充表4）
。 　　所有酵母菌菌株（补充表2）均基于使用乙酸锂/单链载体DNA/PEG方案的野生型菌株CEN.PK2-1C构建
，并具有相同的尿氨酸，组氨酸 ，leucine
，leucine和Photptophan的合适性。使用Casemblr Method45进行了基因组编辑（集成，缺失或交换） 。使用含有25-30 bp Overhangs（IDT）的引物（IDT）的引物（IDT） ，使用Phusion高保真PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）从悬浮的质粒中放大了所有DNA零件
。对于MIA-AU菌株和MIA-AW-2菌株，SpyCAS9是从带有TRP1选择标记的centromeric质粒表达的。对于所有其他MIA菌株
，首先用带有SpyCAS9盒的质粒（TRP1）转化CEN.PK2-1C野生型菌株，然后进行另一种转换 ，以将SpyCAS9 Cassette整合到EasyClone位置XIII-1中
，以进行稳定表达式46 。对于所有编辑，用质粒表达单个或多个靶向的指南-RNA片段 ，以及DNA零件作为修复模板的DNA零件转换因缺乏适当的氨基酸（S）（uracil
，leucine，liucine ，intepine或Pinptpophan）的SC琼脂
，以选择指导-RNA pLASMID和生长3-4天的30-4天
。通过基因分型PCR和综合基因盒的Sanger测序证实了所有具有基因组整合的菌株。 　　对于除MIA-AU和MIA-AW-2以外的所有严格s菌素菌株，在所有基因盒（启动子序列的开始）的开头中都包括一个独特的指南RNA序列 ，以方便地交换启动子或整个基因盒的删除（扩展数据图3A） 。为了将启动子/基因交换在表达盒中
，用表达引导-RNA的质粒以及新的启动子/基因以及该启动子/基因上游的序列与序列重叠（扩展数据图3B）。同样，为了删除整个盒式盒子 ，用表达特定的指南-RNA和两个部分（具有50-60 bp重叠序列）的质粒转化了酵母细胞，这些部分与要删除的基因座的上游和下游同源（扩展数据图3C）
。将转化子铺在缺乏亮氨酸或尿嘧啶的SC琼脂上
，用于选择引导RNA质粒，并通过菌落PCR和测序确认。 　　在SC定义的培养基或富含YPD的培养基中培养酵母细胞 ，均包含2％葡萄糖作为碳源（除了筛选虹膜合酶+环酶和8HGO变体外
，使用葡萄糖和半乳糖） 。对于批处理培养，使用3毫米色氨酸的3×SC培养基（2％葡萄糖）来达到高生物质
。 　　对于所有小规模种植 ，通常是通过在150 µL的SC培养基中种植酵母菌菌落（生物学重复）（缺少适当的氨基酸（用于营养营养性选择）的酵母菌菌落（生物学重复）
，或在96孔微滴定板上的YPD培养基，并在300 r.p.p.p.p.p.p.p.m上搅拌均匀。过夜（大约16–20 h） 。使用生长剖面960系统（Enzyscreen）表征所有酵母菌菌株的最大比生长速率（补充图9）
。所有培养物均在96孔正方形的微量定板中的300μLSC培养基中生长至少3天。培养物在30°C下生长 ，振动速度为250 R.P.M.每30分钟测量细胞密度 。使用指数增长阶段的数据用于确定线性回归的最大特定生长速率
。使用96孔（培养基0.5 mL）或24孔（带2 mL培养基）深孔板进行小规模的生产测定。1天后（通常达到固定相）后
，将10μl的先例转移到缺乏适当的氨基酸或补充一个或多个前体的YPD培养基的SC中 。为了测试严格的生产，用0.1-1 mM色胺和包括香肠 ，8-羟基果仁二醇
，8-氧化剂，8-氧化剂 ，顺式trans-Nepetalactol，loganic Acid
，Loganic Acid，Loganic ，Loganic
，Loganin和Secologanin的前体喂食酵母菌菌株
。为了测试Tabersonine和Catharanthine的产生，用1 mM色胺和50-250μMCecologanin喂食细胞。为了测试Vindoline或Vinblastine的产生 ，分别用100μMTabersonine或100μMVindoline和100μMcatharanthine喂食细胞 。补充表5中列出了进食实验中使用的所有化合物。 　　使用花形板在Bioletractro系统中进行小型喂食培养
。发酵始于将1 ml 3×SC（2％葡萄糖）培养基供应
，该培养基补充了3 mM色氨酸至初始OD600的0.5。使用以下方程式在20小时开始使用相同培养基的连续指数喂养以相同的培养基为单位： 　　其中t是喂食时间（h） 。 　　在整个培养过程中，温度保持在30°C
。使用10％NH4OH溶液以5.5控制pH。盘子以1,000 r.p.m.使用蒸馏水将生长室中的相对湿度保持在85％ ，以最大程度地减少培养基的蒸发 。自动化液体处理程序在第3、5和7天使用0.1 mL培养样品进行代谢物分析
。 　　使用单利用微生物容器在AMBR 250系统上进行批处理发酵。发酵始于将100 mL的3×SC培养基（2％葡萄糖）供应
，这些培养基补充了3毫米色氨酸，至最初的OD600 ，of 5.0 。使用以下方程式在20至96 h之间连续喂入20至96小时之间的同一培养基
，除了36％的葡萄糖外
。 　　在第4和第10天之间，每天将半乳糖的3 g l -1添加到发酵中 ，以诱导catharanthine合酶的表达。在整个发酵过程中，温度保持在30°C 。使用10％NH4OH溶液以5.0控制所有生物反应器的pH
。空气流量最初以每单位单位时间（VVM）单位的1卷为1磅
，并且通过增加搅拌速度，溶解的氧（DO2）保持在40％以上。用气体分析仪监测废气中的二氧化碳 。一个自动液体处理程序每​​24小时服用1.0 mL肉汤样品进行代谢物分析。在栽培结束时 ，所有（150-200毫升）的肉汤均用于粗萃取MIA化合物
，包括Catharanthine和Vindoline
。 　　在某些情况下，使用绿洲（Waters）（Waters）之后 ，使用Oasis HLB（亲水性 - 脂肪平衡）墨盒从发酵汤中提取MIA代谢产物。从96或24孔深板上的所有样品（0.5-2 mL）的固相提取（SPE）均在Oasis HLB 96孔板上进行（SKU 186000679）
，并用0.5 mL的纯甲醇洗脱 。使用二氯甲烷提取从AMBR 250个生物反应器中采集的样品，并通过制备薄层色谱法进一步纯化所得的粗提取物 ，然后是制剂HPLC（补充方法）
。将最终样品用适当量的水溶解
，并用于化学偶联以产生葡萄蛋白酶。 　　在包含1 mM MNCL2的0.1 M TRIS-HCL缓冲液pH 7.0中，对Vindoline和Catharanthine的光化学耦合进行（参考文献38） 。通过在96孔板中添加100μmcatharanthine ，10μmVindoline和50μm黄蛋白单核苷酸来开始反应
。然后将反应（200μl）放在UV-A光（365 nm的峰值波长）下5分钟。暴露后
，加入20μl的100 mM NADH溶液（9.1 mm终浓度），并在0°C下孵育5小时 。在75 mM FECL3和0.05 m HCl中进行Vindoline和Catharanthine的化学耦合 ，含有10％（v/v）2,2,2-三氟乙醇，并在25°C下孵育15分钟
，然后在0°C时减少10 mm Nabh4，持续4°C ，持续4 h h h h h 4 h h（ref
。2）。根据制造商的协议
，使用OASIS HLB 96孔板（水）将所有测定样品保持在-20°C，直到SPE使用SPE 。 　　3或6天后 ，将200μl培养物与20μl的10 mg L -1咖啡因溶液（作为标准化的内标）混合
，并通过滤板（PALL，ACROPREP Advance ，0.2μMSuporpexprance
，for Media/Water）通过2,200G进行1分钟
。为了用于taber素和Vindoline分析，还将MIA-CR-A和MIA-CW-1菌株在4毫升的YPD培养基中在24孔的深孔板上培养6天 ，并且在制造商的协议之后
，使用Oasis HLB 96-WELL PLATE（WATERS）用于SPE。将代谢物用0.8 mL的纯甲醇洗脱，在室温下蒸发至干燥 ，并在100 µL水中重构，并在过滤前与10μl10μl的10 mg L -1咖啡因溶液混合 。以与分析样本相同的方式制备了一系列标准混合物（补充表5）。通常
，注入1μl样品进行分析
。对于从头tab骨，catharanthine和Vindoline菌株 ，注入3μL样品以产生较高的信号。靶向代谢物分析loganic酸
，洛冈宁，secologanin ，stricterosidine
，tabersonine，catharanthine ，catharanthine
，vindoline和vinblastine是使用先进的超HPLC（UHPLC）系统（bruker daltonics）进行的，与EVOQ ELITE TRIPLITE QUADIPEREDSTORT（BRUKER）（BRUKENTICS）（BRUKENTICS）（BRUKENTICS）（brouke septions）（brouk）（brouk）补充表6（在与Orbitrap融合质谱仪（补充方法）（Thermo Fisher Scientific）相关的Dionex Ultimate 3000 UHPLC（Fisher Scientific）上分析了一些分析物（补充方法）的准确质量 。 　　为了分析非极性代谢产物（香肠和8-羟基凝集醇和副产物citronellol） ，使用24孔深板在2 mL培养基中生长细胞
。通过将1.6 mL样品与400 µL乙酸乙酯（含50 µg ml-1 Nerol作为内标）混合1.6 mL样品来提取香精醇和8-羟基毛利
，在4°C摇动30分钟。通过以13,000克离心1分钟将水相分离1分钟，将250 µL的上部（乙酸乙酯）相转移到带有玻璃插入仪的气相色谱瓶中 ，并在气相色谱 - 弹药电离检测器上进行分析 。补充方法中描述了气相色谱和LC -MS程序的详细信息
。 　　根据其报告或预测的结构信息，将YEGFP融合到靶蛋白的N或C末端。将所有YEGFP蛋白均整合到野生型酵母菌菌株中
，并用菌落PCR确认 。核的定位标记（addgene质粒编号133648），内质网膜（addgene质粒编号133647） ，线粒体（addgene质粒号133655）和液泡（Addgene No.133654）
，并纳入了MCHERNE和液泡，并纳入了MCHERNE和FRINSID MATIRES ，并分组为MCHERNE MCHERNE MCHIRES
，DODRERENEYEGFP融合蛋白如前所述47
。菌株在SC-TRP培养基中培养过夜（16-20 h），并在早晨成像 ，或在分析前将隔夜培养物稀释1：5
，并在分析前培养4小时。然后将3 µL培养物应用于客观玻璃上，并用盖玻片覆盖并立即成像 。使用C-Apochromat×63/1.2 W Korr M27水上物镜和ZOOM ，使用C-63/1.2 W Korr M27水上物镜和×4 Scan ZOOM
，使用C-Apochromat×63/1.2 W Korr MIM M27 scan ZOOM获得了共聚焦图像，配备了四个二极管激光器（Carl Zeiss ，Inc
。Axio Imager 2（Carl Zeiss，Inc。）
，配备了四个二极管激光器（Carl Zeiss，Inc 。） ，该图像是共聚焦图像。针孔尺寸设置为1个通风单元
。在0.4-4兆瓦时用488和555 nm激光照明样品。使用光电倍增管检测器获取512×512像素图像 。YEGFP采集参数为：300–578 nm（发射波长范围）
，0.39 µs（线路时间），600-1,000（增益）和0（偏移）
。MCHERRY/DUDRE采集参数为：578–800 nm（发射波长范围） ，0.39 µs（线路时间）
，600–1.000（增益）和0（偏移）。两个通道的平均线八个 。用Zen V.3.2（蓝色版）（Carl Zeiss显微镜GmbH）处理图像
。 　　所有酵母菌菌株均在2 mL的SC或YPD培养基中生长在30°C 300 r.p.m.中的三种生物学重复。2天 。通过以5,000g离心3分钟，将细胞（大约50个OD×ML单位）固定 ，并保持在-80°C
，直到裂解和样品制备
。如前所述48，裂解酵母细胞并提取蛋白质。简而言之 ，它由珠脱珠步骤
，细胞裂解，蛋白质沉淀 ，蛋白质的恢复，蛋白质定量和蛋白质浓度的归一化
，然后是标准的自下而上的蛋白质组学程序，用于减少和阻塞半胱氨酸残基和胰蛋白酶消化 。如前所述49 ，对肽样品进行分析
，该肽样品在Agilent 1290 UHPLC系统上耦合到Agilent 6460QQQ MS（Agilent Technologies）的Agilent 6460QQQ MS（Agilent Technologies）
。简而言之，将肽样品加载到Ascentis ES-C18色谱柱（Sigma-Aldrich）上 ，并使用以阳性离子模式运行的喷气流源（Agilent Technologies）引入MS。使用Agilent Masshunter Workstation软件V.B.08.02获取数据 。LC – MS数据采集在DynamicMRM模式下运行。Skyline软件V.20.2（MACCOSS实验室软件）生成了靶向蛋白质的多个反应监测（MRM）过渡
，而选择标准排除了具有MET/CYS残基的肽，胰蛋白酶肽 ，然后是进一步切割位点（KK/RR）和具有促磷脂的肽
，可与K/R R相邻的肽
。数据和天际线方法可在Panoramaweb（https://panoramaweb.org/microbial-synthesis-of-vinblastine.url）上获得。使用配备有C18易于喷雾柱（Thermo Fisher Scientific）的CAP-LC系统分析了MIA-DJ（Tabersine-dj-Vinblastine双模块）菌株的蛋白质，并与Orbitrap Q精确的HF-X质量光谱仪（Thermo Fisher Scientific）耦合 。使用蛋白质组发现V.2.3（Thermo Fisher Scientific）通过搜索酿酒酵母蛋白质组数据（Uniprot ID UP000002311）来分析所得数据 结合所有异源蛋白序列
。每种蛋白质的丰度据报道是与所有已鉴定肽的总强度的相对强度。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。